载脂蛋白E与糖尿病

刘文，张宁

(1.中国医科大学 95K5B，辽宁 沈阳 110004; 2.中国医科大学 病理生理学教研室，辽宁 沈阳 110004)

载脂蛋白E(apolipoprotein E，Apo E)是一种富含精氨酸的糖基化分泌蛋白，分子量34.2kDa[1]，基因位于人类第19号染色体长臂13区2带，由4个外显子和3个内含子，共3 597个核苷酸组成[2]。其cDNA长1 163 kb，翻译最初产物为含317个氨基酸的蛋白质，后被信号肽裂解，变成由299个氨基酸组成的成熟蛋白[3]。哺乳动物体内约有3/4的Apo E由肝脏实质细胞产生，其余由脾、脑、肺、肾、卵巢、肾上腺及肌肉的细胞或组织产生[1]。

人类的Apo E有3种等位基因,即ε2、ε3和ε4，构成6种不同的基因型，3种纯合型(ε2/ε2、ε3/ε3、ε4/ε4)和3种杂合型(ε3/ε4、ε2/ε3、ε2/ε4)。根据其表型分为E2基因型(ε2/2、ε3/2)、E3基因型(ε3/ε3)、E4基因型(ε4/3、ε4/2、ε4/4)，其中E3为野生型[4]。与E3相比，E2第158位的精氨酸替换为半胱氨酸，E4第112位的半胱氨酸替换为精氨酸[5]。E3和E4表达的载脂蛋白比E2表达的载脂蛋白对低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein-receptor，LDL-R)的亲和力高100倍[6]。

Apo E存在于乳糜微粒(chylomicron，CM)、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)和部分高密度脂蛋白(higy density lipoprotein，HDL)中，且可以与其受体相结合，通过低密度脂蛋白受体(LDL-R)途径和非LDL-R途径发挥清除血脂的作用[7]，其浓度与血浆甘油三酯含量呈正相关。Apo E蛋白质分子可以被凝血酶水解为两个区域，N端(1～191)为22 kD的可溶性球蛋白，此区域较稳定。其中136～158位肽段是受体结合位点，构成反平行的四螺旋束。该区域的碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)在受体结合中起重要作用，一旦被修饰，与受体结合能力显著下降；由209～299氨基酸残基组成的C端结构域螺旋程度很高不稳定，是主要的脂质结合区[8]。该区域存在3个螺旋，其中2个为A型(203～223和225～266)，第三个(268～289)为一种G型螺旋。G螺旋和第二螺旋的末端在脂质连结，在Apo E的四聚体化过程中起重要作用。更精确的说是263～286片段可能在脂连结Apo E与VLDL的结合中起关键作用[9]。

Apo E在血脂清除方面发挥重要功能，其异常可导致动脉粥样硬化和心脑血管疾病。此外，Apo E还参与组织修复、抑制血小板聚集、免疫调节和抑制细胞增殖，以及神经系统的生长及损伤后的修复[10]。在缺血性脑卒中、脑出血、阿尔茨海默病和精神分裂症等疾病的病理过程中发挥重要作用。

1 Apo E异常引发糖尿病的机制

Apo E异常与糖尿病的密切关系已得到广泛的认同。Apo E数量的缺乏、基因多态性所致的蛋白结构变化和Apo E在脂蛋白中的相对分布失衡均能引起血脂代谢异常，进而引发糖尿病。

1.1 血脂代谢异常与糖尿病的关系

大量实验证明，由甘油三酯、VLDL水平升高和HDL水平的降低引起的血脂异常是糖尿病的危险因素之一。临床观察到，血脂异常通常早于糖尿病几年出现，这表明脂蛋白的异常可能诱发了糖尿病的病理过程[11-12]，HDL低的个体更有可能发展为糖尿病，而通过有氧运动增加了HDL的个体表现出糖耐量的提高[13]。脂蛋白对胰岛β细胞的功能、凋亡及增殖等方面具有调节作用：LDL可通过降低胰岛素分泌及限制胰岛β细胞增殖发挥潜在的致糖尿病作用，而HDL可通过抑制胰岛β细胞凋亡发挥潜在的抗糖尿病作用[14]，另外，近期研究发现，脂肪组织通过分泌Ⅰ型血纤维蛋白溶酶原激活物抑制因子、瘦素、肿瘤坏死因子-α、细胞间黏附因子-1、抵抗素、游离脂肪酸等脂肪细胞因子影响胰岛素的敏感性[15]。正常情况下，Apo E参与清除血脂，使其维持在正常的浓度。一旦Apo E的构象或浓度发生了变化，血脂的产生和清除就会失去平衡，从而引发糖尿病。

1.2 Apo E基因的多态性与糖尿病的关系

Apo E2与Ⅲ型高脂蛋白血症有关，E3表达的载脂蛋白比E2表达的载脂蛋白对LDL-R的亲和力高100倍[6]。使用X-ray检晶仪，比较Apo E2和Apo E3在与LDL-R连接时的区别可知，在Apo E3的158位精氨酸与154位天冬氨酸之间存在着一个盐桥，而在Apo E2的150位精氨酸与154位天冬氨酸之间存在另一种可变化的盐桥，这减弱了150位精氨酸在与LDL-R相互作用时的功能[16]。

Apo E4有促进动脉粥样硬化的趋势，携带Apo E4的个体表现出血浆胆固醇和LDL浓度的提高。其可能机制为，Apo E4可优先结合大分子量的脂蛋白颗粒如VLDL和CM残基[17-18]，因而使CM和VLDL残基代谢增速，LDL受体下调，LDL分解代谢减慢，最终导致血浆中CM残粒、VLDL下降，而LDL升高，血胆固醇浓度升高[19]。

综上，Apo E2与Apo E4均可通过相关机制导致血脂代谢异常，进而引发糖尿病，越来越多的研究也将Apo E基因作为糖尿病的常见候选基因之一[20-26]。在一个以人群为基础的病历对照研究中，利用基因相关的Meta分析得到，Apo E2可能为2型糖尿病的中等危险因子[27]；另外，分别检测人2型糖尿病组与对照组ε4的基因频率，测得糖尿病组显著高于对照组，尤其是ε4/4基因型，这提示ε4/4基因型与2型糖尿病有关[28]。

2 糖尿病相关指标对Apo E表达的影响

高血糖、糖基化终末产物积累和胰岛素分泌不足都为糖尿病的主要病理特征。为了研究糖尿病对Apo E表达的影响，实验在高血糖、糖基化修饰与胰岛素分泌不足的环境中培养细胞，模拟糖尿病环境，最终测量细胞中Apo E转录和表达的量。

2.1 高血糖对Apo E表达的影响

2010年的一项实验[29]发现，高血糖在调节脂肪细胞Apo E表达和甘油三酯的代谢和清除中起到抑制作用。将离体脂肪组织暴露于较高浓度的葡萄糖环境中，后测得Apo E的mRNA水平降低了将近80%，蛋白水平降低了60%左右。在体实验中，高血糖亦能导致脂肪组织氧化加重，脂肪组织中脂肪细胞和巨噬细胞Apo E表达水平均显著降低。

无论在离体还是在体环境中，高血糖都可以增加脂肪组织中内源性ROS，通过活化NF-κB转录复合物来促进脂肪组织和细胞中Apo E基因表达的始动过程[30-34]。而当用抗氧化剂或NF-κB途径的抑制剂时，高血糖介导的对脂肪细胞Apo E表达的效应即被抑制。

2.2 糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGE)对Apo E表达的影响

在长期高血糖在体环境中，糖基化终末修饰蛋白在组织中积累。分别在糖基化修饰与对照环境中培养脂肪细胞，结果显示，糖基化修饰的环境可导致Apo E的mRNA及蛋白质含量降低接近60%。糖基化终末产物蛋白与包括RAGE在内的特定受体相结合并活化与基因调节有关的第二信使途径。当使用RAGE抑制性抗体处理时，AGE对Apo E基因表达的抑制作用消失，因此这也说明了RAGE的重要作用[35]。

2.3 胰岛素对Apo E表达的影响

实验使用四氧嘧啶破坏胰岛β细胞终止胰岛素分泌，模拟1型糖尿病胰岛素分泌不足的情况。分别测量糖尿病组与对照组家兔在健康饮食与高脂饮食后，肝脏等组织在稳定状态下的Apo E转录水平。最终测得糖尿病组高脂饮食的家兔肝脏、脑和肾上腺Apo E的mRNA表达均有下降。这种改变说明，家兔胰岛素分泌的绝对缺乏会下调Apo E的基因表达[36]。2型糖尿病为特征的高胰岛素血症、胰岛素抵抗则会引起Apo E水平的提高[36]。

3 Apo E基因敲除小鼠糖尿病相关指标的变化

Hofmann等[37]研究Apo E基因敲除小鼠的糖尿病相关指标后发现：用健康饮食喂养小鼠的情况下，Apo E基因的缺失可导致血浆甘油三酯和胆固醇的清除率明显下降，脂肪组织对脂质的摄取也减少。同时，基因敲除的小鼠血糖和胰岛素的水平低于对照组小鼠，糖耐量有所提高。这说明基因缺失的小鼠胰岛素敏感性更强；当用高脂高糖饮食喂养小鼠时，无论在空腹还是餐后状态下，两组小鼠的胰岛素水平都有所提高，但Apo E基因缺失小鼠胰岛素水平增加明显少于对照组。虽然两组小鼠的血糖水平相似，基因缺失小鼠的低胰岛素水平仍可说明它们对饮食所致的胰岛素抵抗的状态更耐受，保持相对较强的胰岛素敏感性。

Kawashima等[38-39]的实验也得到了相似的结论。他们先使小鼠IGF-1和胰岛素受体失活，得到高胰岛素血症，血脂异常，胰岛β细胞功能紊乱，并逐渐发展为高血糖的Ⅱ型糖尿病模型。然后将小鼠的Apo E基因敲除，发现高胰岛素和高血糖的情况有所好转，说明组织脂肪积累的减少会增加对胰岛素的敏感性。

4 展 望

糖尿病是一种发病原因和病理特点很复杂的疾病，还可引起多种并发症。然而目前的研究多局限于以糖尿病的某些特征和指标代替糖尿病来研究糖尿病对Apo E表达的影响，以Apo E的mRNA水平反映Apo E的蛋白质含量。多种因素的相互作用或多步骤多环节的综合作用可成为影响Apo E基因表达或表达后蛋白质的作用效果。某些情况下，mRNA的水平无法代表蛋白质的含量和功能。在今后的研究中，除了考虑单一变量的影响外，还应该把糖尿病看作一个整体研究。

Apo E可能仅为触发糖尿病的众多因素之一，要想更深入地研究Apo E异常引发糖尿病的机制，可以将其他因素与其联合作用或比较，例如Schreyer等[40]认为，是LDL受体的缺乏，而非Apo E的不足导致了高脂饮食小鼠的肥胖和糖尿病。Apo E的不足只会使小鼠对高血糖和高胰岛素的耐受增强。

[1] MAHLEY R W.Apolipoprotein E:cholesterol transport protein with expanding role in cell biology[J].Science，1998，240(4852):622-630．

[2] RALL S C Jr，WEISGRABER K H，MAHLEY R W.Human apolipoprotein E.The complete amino acid sequence[J].J Biol Chem，1982,257(8):4171-4178．

[3] JAWIEN J,NASTALEK P，KORBUT R.Mouse models of experimental atherosclerosis[J].Physiol Pharmacol，2004，55(3):503-517．

[4] HUBACEK J A，ADAMKOVA V，SKODOVA Z.Rare variant of apolipoprotein E(Arg136→Ser)in two normolipidemic individuals[J].Physiol Res，2005，54(5):573-575．

[5] HAUSER P S，NARAYANASWAMI V，RYAN R O.Apolipoprotein E:from lipid transport to neurobiology[J].Prog Lipid Res，2011，50(1):62-74．

[6] SIEST G，PILLOT T，REGIS-BAILLY A，et al.Apolipoprotein E:an important gene and protein to follow in laboratory medicine[J].Clin Chem，1995，41(8 Pt 1):1068-1086．

[7] EIJI M，KAUZUKO K，MASAKO T，et al.Oxidative modification of low-density lipoprotein and immune regulation of atherosclerosis[J].Prog Lipid Res，2006，45(6):466-486．

[8] SEGALL M L，DHANASEKARAN P，BALDWIN F，et al.Influence of apoE domain structure and polymorphism on the kinetics of phospholipid vesicle solubilization[J].Lipid Res，2002，43(10):1688-1700．

[9] SEGREST J P，JONES M K，DELOOF H，et al.The amphipathic helix in the exchangeable apolipoproteins:a review of secondary structure and function[J].Lipid Res，1992，33(2):141-166．

[10] SCHELLENBERG G D，BOEHNKE M，WIJSMAN E M.Genetic association and linkage analysis of the apolipoprotein CII locus and familial Alzheimer’s disease[J].Ann Neurol，1992，31(2):223-227．

[11] VERGES B.Lipid modification in type 2 diabetes:the role of LDL and HDL[J].Fundam Clin Pharmacol，2009，23(6):681-685．

[12] von ECKARDSTEIN A，SCHULTE H，ASSMANN G.Risk for diabetes mellitus in middle-aged Caucasian male participants of the PROCAM study:implications for the definition of impaired fasting glucose by the American Diabetes Association.Prospective Cardiovascular Munster[J].Clin Endocrinol Metab，2000，85(9):3101-3108．

[13] KRAUS W E，HOUMARD J A，DUSCHA B D，et al.Effects of the amount and intensity of exercise on plasmalipoproteins[J].N Engl J Med，2002，347(19):1483-1492．

[14] RÜTTI S，EHSES J A，SIBLER R A,et al.Low-and high-density lipoproteins modulate function，apoptosis，and proliferation of primary human and murine pancreatic β-cells[J].Endocrinology，2009，150(10):4521-4530．

[15] 庞翠军，肖常青，苏宏业.2 型糖尿病患者游离脂肪酸水平及其影响因素分析[J].广西医科大学学报，2009，26(5):711-713．

[16] LALAZAR A，WEISGRABER K H，RALL S C Jr，et al.Site-specific mutagenesis of human apolipoprotein E.Receptor binding activity of variants with single amino acid substitutions[J].Biol Chem，1988，263(8):3542-3545.

[17] GREGG R E，ZECH L A，SCHAEFER E J.Abnormalinvivometabolism of apolipoprotein E4 in humans[J].Clin Invest，1986，78(3):815-821．

[18] WEISGRABER K H.Apolipoprotein E distribution among human plasma lipoproteins:role of the cysteine-arginine interchange at residue 112[J].Lipid Res，1990，31(8):1503-1511．

[19] ANIL E.The impact of EPA and DHA on blood lipids and lipoprotein metabolism:influence of apoE genotype[J].Proc Nutr Soc，2007，66(1):60-68．

[20] KAMRUECHA W，CHANSIRIKARNJANA S，NIMKULRAT E，et al.Rapid detection of apolipoprotein E genotypes in Alzheimer’s disease using polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism[J].Southeast Asian J Trop Med Public Health，2006，37(4):793-797．

[21] TAVINT HARAN S,LIM S C,CHAN Y H，et al.Apolipoprotein E genotype affects the response to lipid lowering therapy in Chinese patients with type 2 diabetes mellitus[J].Diabetes Obes Metab，2007，9(1):81-86．

[22] MAITLAND van der Zee A H,JUKEMA J W，ZWINDERMAN A H,et al.Apolipoprotein E polymorphism and response to pravastatin in men with coronary artery disease(REGRESS)[J].Acta Cardiol,2006,61(3):327-331．

[23] HUMPHRIES S E，COOPER J A,TALMUD P J，et al.Candidate gene genotypes,along with conventional risk factor assessment,improve estimation of coronary heart disease risk in healthy UK men[J].Clin Chem，2007，53(1):8-16．

[24] FRIKKE-SCHMIDT R，SING C F，NORDESTGAARD B G，et al.Subsets of SNPs define rare genotype classes that predict ischemic heart disease[J].Hum Genet，2007,120(6):865-877．

[25] AKANJI A O，SURESH C G，FATANIA H R，et al.Associations of apolipoprotein E polymorphism with low-density lipoprotein size and subfraction profiles in Arab patients with coronary heart disease[J].Metabolism，2007，56(4):484-490．

[26] SEIP R L,OTVOS J,BILBIE C，et al.The effect of apolipoprotein E genotype on serum lipoprotein particle response to exercise[J].Atherosclerosis，2006,188(1):126-133．

[27] ANTHOPOULOS P G，HAMODRAKAS S J，BAGOS P G.Apolipoprotein E polymorphisms and type 2 diabetes:a meta-analysis of 30 studies including 5 423 cases and 8 197 controls[J].Mol Genet Metab，2010，100(3):283-291．

[28] 熊燏，周新，刘松梅.载脂蛋白E基因多态性与2 型糖尿病的关系[J].微循环学杂志，2008，18(2)：28-29．

[29] ESPIRITU D J，HUANG Z H，ZHAO Y,et al.Hyperglycemia and advanced glycosylation end products suppress adipocyte apoE expression:implications for adipocyte triglyceride metabolism[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2010，299(4):E615-E623．

[30] BHATTACHARYYA S，DUDEJA P K，TOBACMAN J K.Carrageenan-induced NF-κB activation depends on distinct pathways mediated by reactive oxygen species and Hsp27 or by Bcl10[J].Biochim Biophys Acta，2008，1780(7-8):973-982.

[31] ESPIRITU D J，MAZZONE T.Oxidative stress regulates adipocyte apolipoprotein E and suppresses its expression in obesity[J].Diabetes，2008，57(11):2992-2998．

[32] YEOP HAN C，KARGI A Y，OMER M，et al.Differential effect of saturated and unsaturated free fatty acids on the generation of monocyte adhesion and chemotactic factors by adipocytes:dissociation of adipocyte hypertrophy from inflammation[J].Diabetes，2010，59(2):386-396．

[33] LIN Y，BERG A H，IYANGAR P，et al.The hyperglycemia-induced inflammatory response in adipocytes:the role of reactive oxygen species[J].Biol Chem，2005，280(6):4617-4626．

[34] TAKAHASHI M，SUZUKI E，TAKEDA R，et al.Angiotensin II and tumor necrosis factor-alpha synergistically promote monocyte chemoattractant protein-1 expression:roles of NF-κB，p38，and reactive oxygen species[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294(6):H2879-H2888．

[35] CATHERINE M，LENICH A V，CHOBANIAN P B.Effect of dietary cholesterol and alloxan-diabetes on tissue cholesterol and apolipoprotein E mRNA levels in the rabbit[J].Lipid Res，1991，32(3):431-438．

[36] BACH-NGOHOU K，OUGUERRAM K，NAZIH H,et al.Apolipoprotein E kinetics:influence of insulin resistance and type 2 diabetes[J].Int J Obes Relat Metab Disord,2002，26(11):1451-1458．

[37] HOFMANN S M，PEREZ-TILVE D，GREER T M.Defective lipid delivery modulates glucose tolerance and metabolic response to diet in apolipoprotein E-deficient mice[J].Diabetes，2008，57(1):5-12．

[38] KAWASHIMA Y，CHEN J，SUN H.Apolipoprotein E deficiency abrogates insulin resistance in a mouse model of type 2 diabetes mellitus[J].Diabetologia，2009，52(7):1434-1441．

[39] GAO J，KATAGIRI H，ISHIGAKI Y，et al.Involvement of apolipoprotein E in excess fat accumulation and insulin resistance[J].Diabetes，2007，56(1):24-33．

[40] SCHREYER S A，VICK C，LYSTIG T C.LDL receptor but not apolipoprotein E deficiency increases diet-induced obesity and diabetes in mice[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2002，282(1):E207-E214．