前列腺癌动物模型的研究进展

黄烨清，陈明

(东南大学医学院，江苏 南京 210009)

前列腺癌在男性恶性肿瘤中发病率位居第2位，死亡率位居第6位[1]。据美国癌症协会统计，2012年美国约有241 740例新发前列腺癌，有28 170例死于此病[2]。据2012年我国肿瘤协会统计，全国前列腺癌的发病率为9.92/10万[3]。随着蛋白质及基因芯片技术应用于辅助临床诊断，比如P504/AMACR等癌相关基因的检测[4]等，使得前列腺的诊断手段不断提高和多元化。而前列腺癌动物模型是我们进一步研究前列腺癌的发病机制、肿瘤与宿主关系、肿瘤侵袭及转移机制以及评价治疗效果的一个有力的工具。目前已经建立的前列腺癌动物模型，以肿瘤来源形式分类，可分为自发性肿瘤模型、诱发性肿瘤模型、转基因肿瘤模型和种植性肿瘤模型。

1 前列腺癌的自发模型

自发性肿瘤模型是指在不经过有意识的人工干预处理而自然发生的一类肿瘤模型。其优点在肿瘤发生模拟了相对自然状态下动物前列腺癌的发生发展过程。犬类是动物中唯一能够发生前列腺上皮内肿瘤性增生(PIN)和前列腺癌的动物[5]。自发性犬类前列腺癌模型具有高龄易发生、易于转移及晚期易发生激素非依赖性转化，并且有癌灶向骨盆及脊柱进行骨转移的优点，同时患癌犬会出现腰椎疼痛和神经功能障碍有关联的症状。但缺点相对明显，犬类由于自身体积及脾性原因等，实验较难控制，并且化学诱导癌发生率受药品浓度等多因素影响，且肿瘤模型发生耗时长，模型建立耗费量大等，不能较好地适应研究的需要，因而其应用受到限制。

2 诱发性肿瘤模型

常用的化学致癌诱导剂主要有DMAB(3，2′-二甲基4-氨基联苯)[6]和MNU(氮甲基亚硝基尿素)等。激素类诱导剂包括雄激素联合雌二醇诱导和睾酮联合β雌二醇。其中，化学致癌剂MNU和DMAB与长效睾酮诱导的F344大鼠前列腺癌模型的发病率较高，且通过解剖发现肿瘤起源于背侧叶及中叶，此模型与人前列腺癌有相似的生物学行为和特点,可通过血行、淋巴转移，组织分化特点与人类相似。因此，化学致癌剂联合长效睾酮诱导前列腺癌动物模型是相对理想的版本。

3 种植性肿瘤模型

前列腺癌种植模型从种植的部位分，可以分为皮下种植、血管内接种种植、腹腔内种植、靶器官原位种植、肾包膜下种植以及骨骼种植。按肿瘤种植来源分，分为同种种植及异种种植，其中后者较常采用。常用的人前列腺癌细胞系有LNCaP、PC-3、DU-145、CWR22Rv1等。裸鼠因其自身免疫缺陷特性成为了建立人类前列腺癌动物模型的最佳载体，将人类癌细胞通过注射、外科种植等手段接种至裸鼠体内是较常规的模型建立方法。

3.1 皮下种瘤

皮下成瘤的操作简易，对实验室硬件要求相对一般。赵林等[7]报道，通过皮下注射4种前列腺癌细胞DU145、Tsu、PC3和LNCaP，成功制作出荷瘤裸鼠。据报道LNCaP皮下成瘤后，裸鼠血清PSA受裸鼠雄激素水平及瘤体大小影响。将裸鼠行去势手术后，裸鼠PSA下降达80%，并持续4周。随后裸鼠PSA水平逐渐上升至阉割前水平。研究结果提示，前列腺癌有激素依赖性向激素非依赖性的转化，与人类前列腺癌的发病及激素依赖性转变的特点有相似之处。Hara等[8]通过皮下注射LNCaP细胞悬液至去势雄性裸鼠，并用比卡鲁胺连续饲养裸鼠，首次成功地模拟了临床的“抗雄激素药撤退综合征”现象，为研究晚期前列腺的进展，比如前列腺癌的激素依赖性的转变提供了良好的实验平台。

3.2 原位种瘤

外科原位移植瘤技术建立的前列腺癌模型，较好地保留了肿瘤细胞的生物学习性，有着生长快、局部侵犯范围较广且较高的淋巴转移和肺转移率等特点，是较为理想的前列腺癌移植模型。

3.2.1 原位注射成瘤 即解剖暴露膀胱、前列腺及精囊腺，以癌细胞悬液行前列腺被膜下注射，至薄膜鼓起脱离前列腺表面为准[9]。原位注射后模型裸鼠尸检发现，膀胱、精囊腺、前列腺及肠管黏连，不能排除局部癌细胞因注射操作引起的误差。原位注射种瘤技术中最关键步骤在于解剖暴露膀胱，注射癌细胞时可以加入matrigel胶提高成瘤率。

3.2.2 外科原位种瘤术 Bobek等[10]在多次试验后对原位种植技术进行了改进，将前列腺癌细胞接种至裸鼠皮下形成瘤体，再将瘤体取出，分切成1 mm3等体积小块，种植背侧叶，即组织重组技术。然而此方法对操作者技术、实验室硬件条件要求较高，并且操作者须进行专业的训练和反复的练习。

王元天等[11]通过PC-3细胞皮下注射8周后成瘤，取出并修剪小体积后，移植至裸鼠前列腺背侧叶被膜下。9～12周后处死裸鼠。结果显示，90%(18/20)的裸鼠前列腺种植成功；85%(17/20)的瘤组织直径大于1.5 cm；60%(12/20)出现膀胱扩张及肾积水；50%(10/20)出现腹膜后主动脉旁淋巴结转移；20%(4/20)发生肺转移；5%(1/20)发生肺转移；骨转移率为0。此实验成功地应用激素非依赖性PC-3细胞系制成前列腺癌原位模型，但实验中肺转移和主动脉旁淋巴转移的发生早于骨转移，这与人类前列腺癌转移特点有较大差异。此实验虽然成功建立裸鼠前列腺癌模型，但是不能成为前列腺癌骨转移研究的良好模型。

3.3 肾包膜下种植

据van Weerden等[12]报道，肾包膜下种植人类前列腺癌细胞或组织，瘤体同样能获得良好的生长，且其种植成瘤率均优于原位注射种植及皮下种瘤。另外，Wang等[13]通过外科手段将人类来源前列腺癌组织种植至裸鼠肾脏薄膜下，发现种植的癌组织在局部生长后组织形态及免疫组化特性不会受到影响。

孙宏斌[14]采用SVM(小鼠精囊间质)与人类前列腺癌组织在鼠尾胶原中体外重组后，借助微创外科技术将重组体与单纯癌组织种植于裸鼠双侧肾脏包膜下，并且在裸鼠颈部种植睾酮硅胶囊。4周后对裸鼠进行尸检，观察到重组种瘤成功率为100%，而癌组织种瘤成功率为94.1%。肉眼下观重组种植瘤体生长旺盛，重组种瘤方式得到的瘤体体积及重量均优于单纯种瘤组。前者血清PSA值高于后者。通过这种颈部皮下包埋睾酮硅胶囊的方法可以避免动物体激素水平的差异带来的误差。在低分化肿瘤种植组中，观察件SVM向肿瘤间质中侵袭生长，由此可见前列腺癌细胞对正常SVM基质生物学特性产生了影响。

3.4 移植骨种植模型

移植骨转移模型案例较少。Tsingotjidou等[15]报道了通过筛选捡取全髋关节置换术后的骨片，种植于裸鼠后肢皮下，4周后以PC-3和LAPC-4细胞注射至种植骨旁，8至12周进行裸鼠尸检，发现两种细胞系都能引起局部的破骨细胞聚集及活跃的破骨细胞活动。此方法是人类前列腺癌细胞对人类骨骼侵袭的模型，完全避开了物种差异性带来的误差。

3.5 血管内接种模型

这类动物模型是通过在血管内注射前列腺癌细胞悬液，通过血运将前列腺癌细胞送达全身各处器官停留并引起种植。目前主要有尾静脉注射、左心室注射和腔静脉注射等3种方法。

3.5.1 经裸鼠尾静脉注射 Shevrin等[16]通过PC-3细胞悬液形式注射至裸鼠尾静脉，88%(14/16)的裸鼠发生了肺转移，无裸鼠发生骨转移。改进方法，夹闭下腔静脉后从尾静脉注射，使癌细胞不能直接沿下腔静脉回流至肺动脉，而是经椎骨静脉途径回流，结果19%(3/16)发生椎骨转移，而肺转移率降低至31%(5/16)。单纯尾静脉注射能够获得较高的肺转移率及较低的骨转移率，与人前列腺癌转移路径大相庭径,但单纯尾静脉注射癌细胞可以从一个侧面反映癌细胞通过对靶器官种植能力。

3.5.2 左心室注射模型 Angelucci等[17]报道,PC-3细胞悬液通过左心室注射到裸鼠体内40 d后应用X光检查发现,64%的裸鼠发生了腰椎的骨转移及活跃的溶骨性改变;同时，Angelucci应用此方法从模型体内筛选出高转移性亚系PCb2。Tennant等[18]报道，左心室内注射在2～3周后即可发现腰椎骨转移引发病理性骨折。左心室注射骨转移模型，操作上较尾静脉复杂，但可为研究前列腺癌的骨转移的病理生理过程提供了一种良好的动物模型。

3.5.3 腔静脉注射模型 单纯腔静脉注射肿瘤偶见报道，因其注射途径无法避开回流至肺动脉，所以癌细胞的种植途径与尾静脉注射相类似。

3.6 骨转移模型

Fisher等[19]通过胫骨髓腔注射PC-3、Du145和LNCaP细胞悬液，试图建立骨转移模型，结果PC-3组成瘤率为78%(7/9)，Du145组为100%(9/9)，而LNCaP组无骨转移灶形成(0/9)。病理检查显示，Du145组与PC-3组的骨转移灶呈成骨反应与溶骨反应混合型改变。Andresen等[20]应用CWR22Rv1细胞系同样行胫骨髓腔注射，也成功制成前列腺骨转移模型，且在8周后通过微型核素骨扫描得到了客观胫骨骨质破坏的照片证据。胫骨髓腔注射种瘤，具有种瘤效率高，操作相对简易，不受脏器转移干扰等优点，但骨转移骨破坏模型多发生在骨干部，与临床常见的骨骺端转移不同，但从相关的骨质破坏影像及组织病理学检查结果来看，其与临床骨转移引起骨质破坏状况相似，因此成为广泛采用的前列腺癌骨转移模型。

4 基因修饰模型

基因修饰模型主要有转基因模型和基因敲除模型两类。

4.1 基因敲除模型

指利用外用性DNA与受体细胞染色体DNA进行重组，使之整合到预定靶点，并替代原有基因从而改变细胞遗传特性的方法。目前人们已经建立敲除特异性的抑癌基因，如Pten/Mmacl和Mxi1的模型、敲除高度保守的同源框基因NKx3.1制作的模型[21-22]。

4.2 转基因模型

SV40病毒产生的肿瘤蛋白可阻断抑癌基因P53与Rb的信号作用通路，从而引起前列腺癌性突变。Gingrich等[23]通过SV40携带probasin蛋白的启动子的一个片段转入小鼠受精卵细胞中，成功培育成TGAMP小鼠前列腺癌模型。通过后续观测等发现,当TGAMP模型在10～20周龄时，100%的小鼠发生了局灶性前列腺癌，大多数肿瘤位于背侧叶，并且表现出前列腺癌侵袭与转移相应的演进过程。目前，TGAMP小鼠前列腺模型正被应用于前列腺癌去势治疗后病程的模拟过程、胰岛素样生长因子轴与前列腺癌进展的关系等。

以SV40-T为载体建立的转基因小鼠可演进为具有较强侵袭能力的前列腺癌，且有神经内分泌功能等，在研究前列腺癌神经内分泌功能方面起到了帮助。除此以外，Jorcyk等[24]利用SV40携带前列腺蛋白prostatein的基因C3(1)的特异启动子建立的转基因小鼠可以完成演示前列腺上皮内瘤变至侵袭性前列腺癌的整个病理变化过程，从而间接地证明了前列腺上皮内瘤变与原发前列腺癌的关系。转基因模型扩大了前列腺癌动物模型的选择范围，但由于专利原因，获取前列腺癌转基因模型费用高，且转基因建模等待周期长，裸鼠难形成大体积瘤体，难以被常用的影像学检测手段所捕捉到。

5 动物模型的影像学检测评估手段

随着荧光蛋白技术、光学成像技术、超声探测技术、物理技术及数码成像技术的迅猛发展，DR摄片、CT、ECT骨扫描、磁共振、三维超声微成像及活体实时成像技术为我们提供活体观测及检查前列腺癌模型的瘤体创造了机会[25-27]。

荧光蛋白作为活体荧光探针，为我们研究活细胞提供了可视化的可能[28]。在活体荧光成像系统下直接观察肿瘤的生长与转移的过程。Kolostova等[29]报道了通过外科手术原位种植荧光蛋白标记的前列腺肿瘤，并在活体成像系统观测下进行肿瘤的耐药性、转移及血管形成研究的可行性。国内后续由崔明星等[30]报道了通过GFP慢病毒感染的前列腺癌PC-3细胞系，细胞悬液腔静脉注射1周后，即可通过动物活体成像系统直接观测到裸鼠肿瘤的生长与转移情况。3个月后尸检荷瘤鼠，发现裸鼠腰椎有肿瘤浸润，与活体成像结果一致，腰椎转移率为19%。与传统的建立模型方法相比，GFP标记的前列腺癌动物模型具有便于观测、敏感度高、动态连续性好及准确可信度高的特点。

裸鼠体积较小，前列腺原位模型体积更小，超声在不损伤实质脏器的前提下，可准确获得深部瘤体体积。武国军等[31]通过三维超声微成像技术准确地获取4～8月龄的PSP-TGAMP小鼠的前列腺成像，且成功发现了腹腔淋巴转移图像,对实验中11只小鼠瘤体的三维超声图像获得的最大直径结果与大体肿瘤标本测量的数值进行了统计学分析，曲线符合线性回归，皮尔森相关系数为0.998。超声在不损伤实质脏器的前提下，可准确获得深部瘤体体积。与传统的二维超声相比，三维超声能够显著提高超声微成像取得肿瘤体积的准确性和有效性。

目前，前列腺癌的动物模型的骨转移表现主要为骨质破坏与成骨改变。X线摄片发现,骨质破坏通常是发生在早期骨转移2个月后，已滞后于癌灶的疾病进展。而在实验中，我们采用X线摄片技术，可以直接简明地观察到前列腺动物模型的胫骨骨干的骨质破坏情况[32]。

核素骨扫描检查是临床上普遍采用的可及早发现骨肿瘤的辅助检查手段。Winkelmann等[33]利用PC-3细胞进行左心室注射，在接种后21 d微CT检测出腰椎骨骨质0.3 mm的骨破坏灶,并在29 d时采用微SPECT核素显像仪检测出骨转移破坏呈现。核素骨扫描可因骨质的炎症与外伤等因素而易造成骨转移的假阳性结果，要避免这些不利因素的影响才能准确地对动物荷瘤模型进行评价。

综上所述，理想的前列腺癌模型是能够模拟前列腺骨转移发生发展的病理过程，不仅要易于建立与重复，还要能接受精确的检测评价方法。现代前列腺癌动物模型，尤其是利用外科手段及基因手段建立的各种动物模型，是当下前列腺癌研究的重要平台之一。随着更加优良的前列腺癌动物模型的建立，人们必将揭示前列腺癌的发病机制、疾病进展及癌肿侵袭转移过程中的奥秘。

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