响应面法优化棉花黄萎病菌拮抗细菌TUBP1发酵培养基的研究

(新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室/塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔 843300)

棉花黄萎病是由半知菌亚门轮枝菌属真菌-大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb)引起的一种土传维管束真菌性病害，其直接影响产棉区棉花的产量和质量，成为制约棉产区棉花高产和稳产的主要因素[1]。然而，目前针对棉花黄萎病防治没有很有效的药剂。近些年来，随着有机农业和绿色农业兴起，利用生物防治棉花黄萎病已经备受人们关注[2]。细菌因其繁殖速度快、抗逆能力强、易定殖在植物表面，营养要求简单、并且对多种病原真菌、细菌均有较强的抑制作用，具有广谱抗菌性，成为越来越受瞩目的生防研究材料之一[3]，如研究较多的细菌有芽孢杆菌属、小单孢菌属、哈夫尼菌属、假单胞菌属、根瘤菌属和巨大芽孢杆菌等[4-5]，但是引入的生防菌很难在新疆棉田或棉株中定植，这限制生防菌在新疆棉田中的推广与应用，从新疆棉田中分离适应当地棉田的生防菌是一种必然趋势。拮抗细菌TUBP1菌株是本课题组从南疆连作15年棉花根部土壤中分离的拮抗细菌，该菌株发酵液对棉花黄萎菌具有较强的抑制作用，提示此菌可能产生抗菌活性物质，在棉花黄萎病防治方面具有广阔的应用价值和前景。本研究在单因素研究基础上拟采用Box-Behnken设计和响应面法(RSE)对影响棉花黄萎病拮抗菌TUBP1的发酵培养基中氮源、碳源及无机盐因素进行考察和评价，并对这三个主要因素配方进行优化，确定其最佳发酵培养基配方，旨在为进一步棉花黄萎病拮抗菌TUBP1批量发酵和小试生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种

棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaKleb ATCC36211)。

拮抗菌细菌TUBP1：由塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室提供，分离于新疆农一师12团棉田土壤。

1.1.2 培养基配方[7]

NB培养基：20 g葡萄糖，10 g蛋白胨，5 g NaCl，5 g牛肉膏，1 000 mL水PDA培养基：20 g葡萄糖，20 g琼脂，200 g马铃薯，1000 mL水发酵基础培养基：蔗糖1%，蛋白胨1%，NaCl 0.1%，KH2PO40. 2%， pH7. 5。

1.2 方法

1.2.1 TUBP1种子液的制备

拮抗菌TUBP1种子液的制备：将配好的NB培养基分装于250 mL三角瓶中，每瓶装60 mL，121 ℃灭菌30 min后，每瓶接种1 mL拮抗菌TUBP1，37 ℃、180 rpm min-1条件下，摇瓶培养24 h后，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 发酵液制备及预处理

发酵液的制备：在发酵基础培养基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1种子液，37 ℃、180 rpm min-1条件下，摇瓶培养48 h后，置于4 ℃冰箱保存备用。

将发酵液以8 000 rpm min-1的速度离心10 min 去除发酵液中的菌丝体等固体，取上清液，用微孔滤膜(0. 22 μm)抽滤除去上清液中悬浮的杂菌和细小杂质，分装，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 发酵液抑菌活性测定

将棉花黄萎病菌接种PDA平板上，28 ℃培养9天，用直径为9 mm的打孔器取边缘菌块作为菌饼，备用。

将无菌PDA培养基于微波炉中加热使温度降至 45 ℃时，无菌操作下，100 mL PDA培养基中加入20 mL无菌发酵液，摇匀后倒入灭菌的培养皿中，待其铺平凝固，冷却后，在含有发酵液的PDA培养基中央接入病原菌菌饼。25 ℃培养，用游标卡尺每隔2 d计量菌丝生长直径，以不加发酵组为对照组。每个处理重复3次。

菌落直径(cm)=测量菌落直径平均值-0. 9抑制菌丝生长抑制率(%)=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100

1.2.4 发酵培养基中碳源、氮源、无机盐的筛选

碳源的筛选：选取碳源蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉，分别设其浓度梯度为1%、2%、3%，代替发酵基础培养基中的碳源。在发酵基础培养基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1种子液，37 ℃、180 rpm min-1条件下，摇瓶培养48 h后，置于4 ℃冰箱保存备用。然后将发酵液以8 000 rpm min-1，离心10 min，去除发酵液中的菌丝体等固体，取上清液，用微孔滤膜(0. 22 μm)抽滤除去上清液中悬浮的杂菌和细小杂质，分装，备用。发酵液抗菌活性参照1.2.3，计算抑制率，比较拮抗细菌TUBP1发酵培养基中不同碳源对棉花黄萎病的抑制率，筛选出最佳碳源。

氮源的筛选：选取氮源酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏，分别1%、2%、3%三个浓度梯度，并替换发酵基础培养基中的氮源。在发酵基础培养基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1种子液，37 ℃、180 rpm min-1条件下，摇瓶培养48 h后，置于4 ℃冰箱保存备用。然后将发酵液以8 000 rpm min-1的速度离心10 min 去除发酵液中的菌丝体等固体，取上清液，用微孔滤膜(0. 22 μm)抽滤除去上清液中悬浮的杂菌和细小杂质，分装，备用。发酵液抗菌活性参照1.2.3，计算抑制率，比较拮抗细菌TUBP1发酵培养基中不同氮源对棉花黄萎病的抑制率，筛选出最佳氮源。

无机盐的筛选：选MnCL2、FeSO4、CuSO4分别设0. 1%、0. 3%、0. 5%三个浓度加入发酵基础培养基中。在发酵基础培养基中以每50 mL溶液加入1 mL的拮抗菌TUBP1种子液，37 ℃、180 rpm min-1条件下，摇瓶培养48 h后，置于4 ℃冰箱保存备用。然后将发酵液以8 000 rpm min-1的速度离心10 min 去除发酵液中的菌丝体等固体，取上清液，用微孔滤膜(0. 22 μm)抽滤除去上清液中悬浮的杂菌和细小杂质，分装，备用。发酵液抗菌活性参照1.2.3，计算抑制率，比较拮抗细菌TUBP1发酵培养基中不同无机盐对棉花黄萎病的抑制率，筛选出最佳无机盐。

1.2.5 试验设计及响应面优化

采用统计软件Design Expert.V8.06，按照Box-Behnken中心组合设计原理，进行3因素3水平的响应面分析实验。以抑制率为响应值(Y)，碳源(X1)氮源(X2)和无机盐(X3)分别为自变量，其中碳源、氮源、无机盐由1.2.4筛选获得。发酵培养基优化试验的因素、水平设计见表1

表1 TUBP1 菌株发酵培养基优化实验的因素和水平

2 结果与分析

2.1 碳源的筛选

图1 碳源对棉花黄萎病拮抗菌TUBP1发酵液抑菌活性影响

由图1可知，棉花黄萎病菌拮抗细菌TUBP1发酵培养基中不同碳源(淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖)对棉花黄萎病菌抗菌活性的影响。拮抗细菌TUBP1发酵培养基中淀粉含量为1%、2%、3%时，对棉花黄萎病菌抑制率分别为25. 9%、42. 75%、14. 5%；拮抗细菌TUBP1发酵培养基中蔗糖含量为上述三个浓度梯度时，对棉花黄萎病菌抑制率分别为21%、21. 4%、16%；拮抗细菌TUBP1发酵培养基中麦芽糖含量为1 %，2 %，3 % 时，抑制率分别为37 %，36. 7%，32. 8%；拮抗细菌TUBP1发酵培养基中葡萄糖含量在上述浓度梯度时，抗菌活性抑制率分别为40. 5%，43%，39%；由以上数据可得，棉花黄萎病菌拮抗细菌TUBP1发酵培养基中碳源为葡萄糖时，发酵液抗菌活性最好；其中葡萄糖浓度为2% 时，发酵液抑制率最高为43%。

2.2 氮源的筛选

图2 氮源对棉花黄萎病拮抗菌TUBP1发酵液抑菌活性影响

由图2可知，棉花黄萎病菌拮抗细菌TUBP1发酵培养基中不同氮源(蛋白胨、牛肉膏、胰蛋白)对棉花黄萎病菌抗菌活性的影响。拮抗细菌TUBP1发酵培养基中氮源含量为1%、2%、3%时，其中氮源为蛋白胨，拮抗菌TUBP1发酵液抗菌活性抑制率分别为45. 8%、42. 4%、47. 9%；其中氮源为牛肉膏，拮抗菌TUBP1发酵液抗菌活性抑制率分别为45. 4%，46. 8%，44. 3%；氮源为胰蛋白，拮抗菌发酵液抗菌活性抑制率分别为：41. 8%，38. 2%，40. 1%；由以上数据可得3%蛋白胨的抑制率最高为47. 9%。

2.3 无机盐的筛选

图3 无机盐对棉花黄萎病拮抗菌TUBP1发酵液抑菌活性影响

由图3可知，棉花黄萎病菌拮抗细菌TUBP1发酵培养基中不同无机盐(硫酸铜、硫酸亚铁、氯化锰)对棉花黄萎病菌抗菌活性的影响。在无机盐浓度为0. 1%、0. 3%、0. 5% 时，硫酸铜的抑制率分别为32. 7%，35. 6%，35. 2%；硫酸亚铁的抑制率分别为29. 1%，28. 6%，35%；氯化锰的抑制率分别为：47%，26. 7%，40. 2%。由以上数据可知，拮抗细菌TUBP1发酵培养基中无机盐为氯化锰的抑制率较好；且浓度为0. 1%时，抑制率最高为47%。

2.4 响应面分析的实验设计及结果

2.4.1 响应面方差分析结果

表2 响应面分析实验表及实验结果

表3 响应面方差分析结果表

利用Design Expert.V8.06软件，对Box-Benhnken试验结果进行二次多项回归拟合，获得拮抗菌TUBP1发酵抗菌活性对葡萄糖、蛋白胨和无机盐的多元二次回归方程: Y=52. 16-1. 408 75A+0. 866 25B-3. 225C+0. 317 5AB-0. 05AC+0. 5BC-2. 396 25A2-2. 196 25B2-3. 013 75C2式中：Y为抑菌活性单位，A为葡萄糖，B为蛋白胨，C为无机盐。

2.4.2 响应面图分析

响应面图形是响应值Y(抑制率)对应与实验因素X1、X2和X3(X1为碳源，X2为氮源，X3为无机盐)所构成的三维空间的曲面图及其在二维平面上的等高线图，其可以直观的反映各因素及它们之间的交互作用对响应值的影响，结果见图4-6。

图4 蛋白胨和葡萄糖对TUBP1菌株抑菌活性影响的响应面和等高线图

图5 无机盐和葡萄糖对TUBP1菌株抑菌活性影响的响应面和等高线图

图6 无机盐和蛋白胨对TUBP1菌株抑菌活性影响的响应面和等高线图

由图4可知，随着拮抗菌TUBP1发酵培养基中蛋白胨和葡萄糖浓度的增大，TUBP1菌株发酵液对棉花黄萎病菌抑菌率先快速提高后缓慢降低，由此可见，适当的增大发酵培养基中蛋白胨和葡萄糖含量，可以一定程度提高菌株抑菌率。从图5可以看出，随着发酵培养基中无机盐与葡萄糖提高，菌株抑菌率也表现为先增大后降低。从图6中，发酵培养基中无机盐及蛋白胨对拮抗菌TUBP1发酵液抑菌率的影响与图5相似，因此，在实际操作中，应慎重控制葡萄糖、蛋白胨及无机盐，以获得较高的抑制率。

2.5 验证试验

根据所得模型，利用Design Expert.V8.06软件对工艺条件进行优化，在模型取值范围内选择最低点为起始点，由模型使用快速上升法进行优化，可预测在稳定状态下的最优工艺条件为葡萄糖2. 58%、蛋白胨2. 96%、MnCl20. 048%。在此条件下TUBP1菌株的抑菌率理论上可达53. 3%。为了验证试验结果是否与真实情况相一致，根据上述试验结果进行了近似验证实验，做了6组验证实验，结果如表4所示。

表4 最佳工艺条件验证结果

由表4可以看出，在最佳工艺条件下，拮抗细菌TUBP1菌株发酵液的抑菌率平均值实可达53. 63%，与预测值接近，与理论值偏差小于5%，且重复性也很好，因此进一步验证了实验结果，说明优化结果可靠。

3 结论与讨论

随着绿色农业的兴起，棉花黄萎病菌的生物防治是棉花病害防治的研究热点。这源于微生物农药具有环境友好、高效、低毒、残留少等特点。拮抗微生物产生的次生代谢产物是其主要抗菌方式之一，通过对其天然抗菌活性物质的筛选，为开发新的农用药物研究奠定基础。本课题组从新疆棉花连作棉田土壤中分离一株棉花黄萎病菌拮抗菌株TUBP1，对其发酵液中活性成分分析，有望开发成新型农用抗生素。为了获得TUBP1发酵液中高活性抗棉花黄萎病菌活性成分，对其发酵培养基成分优化是必要条件。

本文通过单因子实验筛选出TUBP1发酵培养基的最佳碳源、氮源和无机盐，并首次采用Box—Behnken设计和响应面法，优化拮抗菌TUBP发酵培养基碳源、氮源和无机盐的最佳配比，获得了发酵培养基的优化模型：Y=52. 16-1. 408 75A+0. 866 25B-3. 225C+0. 317 5AB -0. 05AC+0. 5BC-2. 39625A2-2. 19625B2-3. 01375C2，通过摇瓶验证，实验值与预测值拟合良好。

通过培养基优化模型得到拮抗菌TUBP1发酵培养基组成为葡萄糖2. 58%；蛋白胨2. 96%；MnCl20. 048%时，发酵液抗菌活性最好，抑制率为53. 63%。

响应面分析法(RSM)是一种在多因素系统中寻找最优工艺参数的数学统计方法，它包括多种实验设计(Plackett-Burma、Box-Behnken、Central composite design等)、建模、因子效应评估以及寻求因子最佳操作条件，该方法已经成功应用于各种微生物培养条件优化实验中[8]，本实验进一步验证此结果。

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