乳苣水提取物诱导肺癌细胞H1299和A549的凋亡

张彩艳,刘小敏,华子义,贺燕云

(上海大学 生命科学学院,上海 200444)

据世界卫生组织(WHO)统计,全世界每年有1000万新发癌症患者,600万人死于癌症,癌症几乎是死亡的代名词.目前,治疗癌症的措施有手术、化疗、放疗和免疫治疗等方法,但其治疗效果都不理想.由于中药的毒副作用低,能提高机体的免疫力,所以越来越多的中晚期癌症患者选择中药治疗,许多报道也证明了中药在抗肿瘤复发、转移中的优势.因此寻找能预防癌症并能长期服用的高效无毒的中草药成为迫切的问题.

药食两用植物乳苣(Mulgediumtataricum(Linn.) DC.)为菊科乳苣属植物,又名蒙山莴苣、紫花山莴苣、苦菜等,多年生草本植物,民间作为野菜采食,有抗菌、消炎、止痛等功效.已有的对乳苣的研究主要集中在对乳苣的总黄酮和多酚的提取和抗氧化方面的研究[1-4].天然的黄酮类化合物具有抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松,它具有清除自由基、超氧化物和羟基自由基、抑制脂质过氧化及抗癌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用[5-6].王小雄等从乳苣全草中分离到41种化合物,其中3种物质莴苣素-8-O-对甲氧基苯乙酸酯、莴苣素、山莴苣素被实验证明能够抑制体外培养的人的白血病细胞(HL-60)和人肝癌细胞(SMMC-7721)的生长[7-8].本文作者想要验证乳苣作为中草药对癌细胞的抑制作用,所以直接用沸水浸泡乳苣所得的水提取物作用于体外培养的人肺癌细胞株H1299和A549,探讨乳苣的水提取物对肿瘤细胞的生长抑制及诱导细胞凋亡的作用,为保健品和新药的研究开发提供线索.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

人肺癌细胞株H1299和A549;购自中国科学院上海细胞生物学研究院.

1.1.2 主要试剂

乳苣(Mulgediumtataricum(Linn.) DC.)为菊科乳苣属植物,采于晋西北农田,由上海大学生命学院王伟博士鉴定.RPMI-1640培养基(CORNING);胎牛血清(Hyclone);胰蛋白酶(Hyclone);Penicillin-Streptomycin Solution(Hyclone);CCK-8试剂盒(上海七海复泰生物公司);Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒(上海七海复泰生物公司);线粒体膜电位检测试剂盒(Jc-1)(碧云天生物公司).

1.1.3 主要仪器

流式细胞仪为Moflow XDP;CO2培养箱;酶标仪为美国BioRad产品;倒置显微镜为LEICA 公司产品;冷冻干燥机为美国LABCONCO公司产品.

1.2 实验方法

1.2.1 乳苣水提取物制备

采全草,阴干,-80 ℃保存.将8 g的干乳苣,粉碎,浸泡到100 mL沸水中,超声1 h,沸水浴30 min,过滤2次,分装原液经48 h冷冻干燥后制成冻干粉,-80℃保存,备用.使用时,用培养基重新溶解冻干粉,0.22 μm滤膜过滤后使用.

1.2.2 细胞培养

以含10%新生牛血清、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基培养H1299和A549,37 ℃、5 % CO2,恒温培养箱中常规消化传代.

1.2.3 细胞形态观察

细胞均匀铺在24孔板中,待细胞贴壁生长至覆盖培养板底部50%～60%时,用不同浓度乳苣水提取物处理细胞48 h,另设不加药的空白对照,每个剂量设3个重复,在光学显微镜下观察细胞形态.

1.2.4 细胞增殖活力检测(CCK-8法)

将细胞均匀铺于96孔板中,待细胞贴壁生长至覆盖培养板底部50%～60%时,用不同浓度乳苣水提取物处理细胞48 h,检测前4 h先换无血清培养基培养,每孔加5 μL CCK-8溶液,避光温育1～2 h,用酶标仪测450 nm下的吸光值,每个剂量重复4次,实验重复3次.

1.2.5 Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡

不同浓度乳苣水提取物处理细胞48 h后收集到的细胞,取200 μL loading buffer悬浮细胞,2.5 μL FITC染色,室温避光处理15 min,再用5 μL PI染色,冰浴避光处理5 min后上流式细胞仪检测,用Summit 5.2 获取数据并分析.

1.2.6 细胞膜电位的检测

不同浓度乳苣水提取物处理细胞48 h后收集到的细胞,加入Jc-1染色工作液后,避光温育20 min.染色完成后,用1 mL Jc-1(5X)与4 mL超纯水比例配制的Jc-1(1X)洗涤缓冲液(冰浴)洗涤2遍后流式细胞仪检测,用试剂盒提供的CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照.用FL1(FITC)和FL2(RPE-TR)通道接收信号.

1.2.7 统计学处理

所得数据采用GraphPad Prism5软件进行统计学分析,以P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结 果

2.1 乳苣水提取物对H1299和A549细胞形态的影响

如图1所示,不同浓度乳苣水提取物分别作用H1299和A549细胞48 h后,光镜下直接可见未给药对照组细胞贴壁状况良好,细胞透明,折光性好;浓度达到1.2 mg/mL的处理组密度明显降低,细胞贴壁能力减弱,细胞皱缩,出现了明显的凋亡形态学特征.

图1 不同浓度乳苣水提取物对H1299和A549细胞生长的影响 (A:H1299; B:A549)

2.2 乳苣的水提取物明显抑制了H1299和A549细胞的增殖

如图2所示,乳苣水提取物作用H1299和A549细胞48 h后,对细胞的增殖有明显的抑制作用.乳苣对H1299增殖的抑制作用与其剂量、作用时间呈正相关,实验组的增殖抑制作用与空白对照组比较,均有显著性差异(P<0.05).对于A549细胞,处理浓度达到1.2 mg/mL时,细胞的增殖抑制程度与空白对照组比较,有显著性差异(P<0.05).

2.3 乳苣水提取物诱导H1299和A549细胞的凋亡

在细胞凋亡的早期阶段,胞浆膜磷脂的不对称性丧失,导致膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内层暴露于外层,从而可被PS特异的AnnexinV探针所标记,PI不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染.因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来.流式AnnexinV-FITC/PI双参数图(图3,4)可见,右下象限(FITC+/PI-)和右上象限(FITC+/PI+)分别代表细胞的早期凋亡和晚期凋亡,左下象限为活细胞(FITC-/PI-),左上象限为坏死细胞(FITC-/PI+).不同剂量的乳苣水提取物作用H1299细胞的平均凋亡率分别为10.5%、13.36%、15.36%、21.2%、36.01%、96%,作用A549细胞的平均凋亡率分别为8.31%,7.33%,15.56%,44.2%,46.82%,当处理浓度达到1.2 mg/mL,作用48 h后,处理组凋亡率与对照组相比均有显著性意义(P<0.05).

图2 不同浓度乳苣的水提取物对H1299和A549细胞增殖的影响

图3 不同浓度乳苣的水提取物作用H1299细胞凋亡的检测

图4 不同浓度乳苣的水提取物作用A549细胞凋亡的检测

2.4 乳苣水提取物处理H1299和A549细胞后细胞膜电位下降

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡的一个标志性事件[9].在线粒体膜电位较高时,探针JC-1聚集在线粒体的基质中,形成聚合物,产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体,产生绿色荧光.因此可通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化.如图5所示活细胞线粒体膜电位高,线粒体内JC-1聚合物的浓度高,红色荧光很强,在流式图上表现为双阳性,而凋亡细胞则大多为FITC单阳性.用带红色荧光信号的细胞比例的下降来表示线粒体去极化程度,乳苣水提取物处理H1299和A549 48 h后,经JC-1染色,双阳性细胞随着药物浓度的增加逐渐减少,表明乳苣水提取物处理细胞后,细胞的膜电位明显下降,结合前期的实验结果表明乳苣确实能诱导肺癌细胞H1299和A549凋亡.

图5 不同浓度乳苣水提取物作用H1299和A549细胞膜电位的变化 (A:H1299; B:A549)

3 讨 论

近年我国各类癌症发病率日益上升,迫切需要找出既能抑制癌细胞增殖又对人体危害较少的药物,因此开发天然抗癌药物成为研究热点.本研究中的菊科乳苣属植物乳苣(Mulgediumtataricum(Linn.) DC.)为药食两用野生植物,我国晋西北人长期采食,以其特有的苦寒属性及所含成份,煮熟放置后长期不馊、食后具有泄热宁神、清心明目、消炎解毒作用.由于苦菜的食用方法多为沸水煮食或阴干后泡食,所以实验材料用阴干的乳苣全草的水浸泡提取物作用于癌细胞,以此探索乳苣水溶状态下对癌细胞的作用.这样的研究为开发乳苣这种食用野菜,寻找预防和治疗癌症的新药物提供理论基础.

图6 不同浓度乳苣水提取物作用H1299和A549细胞,细胞内活性氧水平检测 (A:H1299; B:A549)

本实验观察了乳苣水提取物对体外培养的肺癌细胞H1299和A549生长、增殖、凋亡的影响.虽然低浓度剂量组(0.4 mg/mL)在细胞形态和增殖活力检测的结果中与对照组相比差异不是很明显,但是流式的检测结果表明,当浓度低至0.4 mg/mL时,乳苣水提取物作用48 h对H1299细胞有诱导凋亡的作用,但当浓度达到1.2 mg/mL时才能明显地诱导A549细胞的凋亡.本实验中同时观察了另外一种十字花科芸薹属蔬菜青菜对这两株细胞生长的影响,用同样方法处理材料,高浓度(2 mg/mL)的青菜水提取物处理肺癌细胞H1299和A549 48 h后却能很明显地促进细胞的生长(结果未显示).由于乳苣这种食用植物中同样也含有有利于细胞生长的营养成分,低浓度时促进细胞生长,但高剂量的乳苣提取物,抑癌活性物质的浓度也会增加,这些活性物质诱导了细胞的凋亡,而青菜中并不含有抑制肺癌细胞生长的活性物质,所以较高浓度下并不能诱导癌细胞凋亡,说明乳苣这种食用野菜中确实含有能抑制癌细胞生长的活性物质.

所有数据表明乳苣水提取物可以明显地抑制体外培养的肺癌细胞H1299和A549的增殖,而这种抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的,药物处理后细胞膜电位的下降说明这种凋亡可能是线粒体凋亡途径介导的.后期将对乳苣水提取物诱导肺癌细胞H1299和A549凋亡的机制和对体内生长的细胞的影响做进一步研究,这对临床应用将有十分重要的指导意义.

参考文献:

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