污泥深度脱水对四环素耐药菌和耐药基因的去除特性

谭国赣,杜勇立,黄满红,张 微

(1.中建五局土木工程有限公司,长沙 410004； 2.湖南省交通规划勘察设计院,长沙 410008；3.东华大学 环境科学与工程学院,上海 201620)

0 引 言

污水处理厂污泥是污水处理的产物,每1×104m3污水经处理后约产生污泥(按含水率80%计)5～10×104kg[1].污泥中可能含有大量的重金属物质、病原菌、病毒微生物和大量的毒性有机物,如不加以妥善处理和处置,将造成堆放和排放区周围环境严重的二次污染,污泥的处置已成为一个全球性的环境问题[2-4].

抗生素是广泛使用的杀菌药物,经人类和动物使用后部分进入污水处理系统中,微生物在持续抗生素选择压力下产生了耐药性形成耐药菌,以及可能通过质粒和整合子等广泛传播,使得污水处理系统成为抗生素耐药菌和耐药基因的储库[5-6],而污泥中含有非常高的微生物量和丰富的营养,污泥是发生耐药基因水平转移的高发区,含有耐药菌和耐药基因的污泥的使用和填埋,会增加病原微生物感染人群的风险[7-8].尽管目前对污泥脱水减容技术有较多的研究[9-11],但是还没有对污泥深度脱水中耐药菌和耐药基因的去除特性进行研究的报道.

四环素具有广谱抗菌性、毒副作用小、成本低廉等优点,是广泛使用的药物.其在生物体内代谢程度很低,未经代谢后的残留物可在环境中停留很长时间,因此在四环素的持续压力下,研究者相继在污水、饮用水和河水中检测出四环素耐药菌和四环素耐药基因[12-15].本研究采用传统平板法对四环素耐药菌进行测定,采用RT-PCR对污水厂中四环素类耐药基因数量进行测定,对污泥深度脱水中4种四环素耐药基因的去除特性进行分析,以期为污泥中四环素类耐药菌和四环素耐药基因的控制提供参考.

1 实验材料与方法

1.1 样品的采集

为分析四环素类耐药菌和耐药基因的去除情况,本实验对中国南方某大型城市的市政污水处理污泥进行采样测定,其中原生污泥(即深度处理前污泥)取自某污泥深度处理设施的进料斗,深度脱水后污泥取自该设施配套的大型污泥填埋场.

污泥深度脱水工艺为:原生污泥首先与浓缩污泥(或者自来水)混合至含水率90%左右,然后添加CaO(污泥干基的20%)和FeCl3(污泥干基的3%)调理,最后经板框压滤至含水率低于60%.

1.2 实验方法

1.2.1 耐药细菌的培养

本实验以LB营养肉汤培养基作为可培养菌落数测定培养基.将四环素加入LB培养基中,制成四环素浓度为20 μg·mL-1的LB培养基作为四环素耐药菌选择性培养基.实验采用在0.85%生理盐水中添加0.01%焦磷酸钠作为稀释缓冲液对水样进行震荡破碎,焦磷酸钠是解絮凝剂,添加的目的是为了将活性污泥中菌胶团打散,以使菌胶团中细菌得到较充分培养.无菌操作取水样5 mL,放于装有45 mL灭菌缓冲液的三角烧瓶内,瓶内预置适当数量玻璃珠,恒温摇床内180 r/min剧烈震荡2 h,制成稀释10-1菌液.出水水样直接震荡,不经过稀释.用1 mL灭菌移液吸管吸取稀释液1 mL,缓慢注入含有9 mL灭菌缓冲液的试管内,震荡试管混合均匀,制成10-2稀释菌液.同法依次连续稀释至10-3、10-4、10-5稀释菌液.针对每个采样点水样选择3个适宜稀释度,每个稀释梯度做3个平行样,吸取0.1 mL稀释菌液,加在已灭菌的培养皿中,涂布法涂布均匀,37 ℃恒温生化培养箱中培养24 h后计数,以上无菌操作均在超净台中进行.

1.2.2 四环素耐药基因测定

采用Real-time PCR绝对定量法,以细菌16S V3区通用引物357F、518R扩增总菌为内参照,检测不同水环境中这些耐药基因绝对含量,并与总菌相对照.设计耐药基因tet(A)、tet(B)、tet(M)和tet(X)特异性引物,并构建绝对定量质粒检测不同水环境中这些耐药基因绝对含量,并与总菌相对照.引物序列由Primer Premier 5.0软件设计,目的基因片段及方法如表1所示.

表1 4种耐药基因测定的引物和方法设定[16]

2 结果与讨论

2.1 污泥深度脱水前后性质

对深度脱水污泥的理化性质进行分析,结果见表2和图1.

表2 深度脱水污泥脱水前后理化特性

污泥填埋场内深度脱水污泥为颗粒状和块状,呈灰黄色,结构松散,密实性较差,含有少量塑料薄膜碎片,由于调理过程投加大量CaO形成碱性环境,伴有强烈的氨气臭味.

2.2 污泥深度脱水对四环素耐药菌的影响

污泥脱水前后四环素耐药菌的变化见表3.

表3 污泥脱水前后四环素耐药菌的变化

从表3可以看到,污泥深度脱水前后四环素耐药菌均存在,经深度脱水处理后可培养菌落总数及四环素耐药菌落数都呈下降趋势,说明深度处理对四环素耐药菌有一定的去除效果.污泥调理过程中,除了通过改变斥力,压缩内部结合水外,还由于在调理过程中,pH大幅上升至碱性,改变细菌结构或破坏细胞,从而去除或者杀死了耐药菌.四环素耐药菌占总菌落数的百分比没有明显下降或上升,相比于脱水前的33.5%,出水仍然保持在31.8%左右.说明深度脱水没有选择性地富集或去除四环素耐药菌.

2.3 四环素耐药基因的去除特性

荧光定量PCR测定耐药基因的原理是随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加.每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图.实验获得的总菌(内参)定量标准品扩增曲线图见图1.

图1 总菌内参定量标准品扩增曲线(横坐标为循环次数,纵坐标为荧光强度)

污泥深度脱水前,总菌的基因拷贝数是4.21×108copies/mL,污泥深度脱水后,总菌的基因拷贝数是4.21×108copies/mL,去除率是59.62%.tetA,tetB,tetM和tetX的浓度和去除效率如图2所示.

从图2中可以看出:

(1) 污泥深度脱水前后中4种四环素耐药基因均被检出,4种四环素耐药基因浓度在经历深度脱水后都有一定程度的下降,其中tetA,tetB,tetM的去除率能达到80%以上,但是tetX的去除率较低,只有45.6%.

(2) 污泥深度脱水过程中四环素耐药基因浓度远低于总菌浓度,两者相差1～4个数量级.总菌基因的去除率为59.6%,相对tetA,tetB,tetM来说较低.

(3) 污泥深度脱水后四环素耐药基因并没有全部去除,尤其是tetX的去除率较低,说明经过污泥深度脱水处理后,污泥中的耐药基因还会对环境造成潜在风险.

图2 耐药基因的浓度和去除效率

3 结 论

(1) 污泥深度脱水前后四环素耐药菌均存在,经深度脱水处理后可培养菌落总数及四环素耐药菌落数都呈下降趋势,说明深度处理对四环素耐药菌有一定的去除效果.但是深度脱水没有选择性地富集或去除四环素耐药菌.

(2) 四环素耐药基因浓度在经历深度脱水后都有一定程度的下降,其中tetA,tetB,tetM的去除率能达到80%以上.

(3) 污泥深度脱水处理后不能完全去除耐药基因,污泥中的耐药基因还会对环境造成潜在风险.

参考文献:

[1] 张辰.污泥护理处置技术与工程实例[M].北京:化学工业出版社,2006.

[2] TYAGI V K,LO S L.Sludge:A waste or renewable source for energy and resources recovery[J].Renewable and Sustainable Energy Reviews,2013,25:708-728.

[3] 陈涛,孙水裕,刘敬勇,等.城市污水污泥焚烧二次污染物控制研究进展[J].化工进展,2010,29(1):157-167.

[4] 唐小辉,赵力.污泥处置国内外进展[J].环境科学与管理,2005,30(3):68-74.

[5] FROLUND B,PALMGREN R,KEIDING K,et al.Extraction of extracellular polymers from activated sludge using a cation exchange resin[J].Water Research,1996,30:1749-58.

[6] GUARDABASSI L,DIJKSHOORN L,COLLARD J M,et al.Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains[J].J Med Microbiol,2000,49:929-936.

[7] PRADO N,OCHOA J,ABDELTIF A.Biodegradation and biosorption of tetracycline and tylosin antibiotics in activated sludge system[J].Process Biochem,2009,44(11):1302-1306.

[8] PRADO N,OCHOA J,ABDELTIF A.Biodegradation by activated sludge and toxicity of tetracycline into a semi-industrial membrane bioreactor[J].Bioresource Technology,2009,100(15):3769-3774.

[9] 姚萌,程国淡,谢小青,等.城市污水厂污泥化学调理深度脱水机理[J].环境工程学报,2012(6):2787-2790.

[10] 魏源送,樊耀波.污泥减量技术的研究及其应用[J].中国给水排水,2001,20(7):23-26.

[11] 杨造燕,匡志花,顾平,等.膜生物反应器无剩余污泥排放的研究[J].城市环境与城市生态,1999,12(1):16-18.

[12] KUMMERER K.Significance of antibiotics in the environment[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy,2003,52(1):5-7.

[13] MO L,S LC S,Antibiotic prescription rates vary markedly between I3 European countries[J].Scand J Infect Dis,2002,34(5):366-371.

[14] KUMMERER K A A,Biodegradability of some antibiotics,elimination of their genotoxicity and affection of 135 waste water bacteria in a simple test[J].Chemosphere,2000,40(7):701-710

[15] MUNIR M,WONG K,XAGORARAKI I.Release of antibiotic resistant bacteria and genes in the effluent and biosolids of five wastewater utilities in Michigan[J].Water Research,2011,45:681-693.

[16] ZHANG W,HUANG M H,QI F F,et al.Effect of trace tetracycline concentrations on the structure of a microbial community and the development of tetracycline resistance genes in sequencing batch reactors[J].Bioresource Technology,2013,150:9-14.