植酸钛纳米材料固定酶制备过氧化氢传感器

潘羽侠,董 洁,叶平平,李梦珠,诸莹婕,向 媛,杨海峰

(上海师范大学 生命与环境科学学院,上海 200234)

0 引 言

近年来,具有层状结构的磷酸盐已被人们广泛研究.其制备方法一般主要有溶胶凝胶法[1]、水热合成法[2]、溶剂热合成法[3]等.微波合成法是最近迅速发展起来的一种绿色、快速、高效的材料合成新技术[4],自20世纪70年代中期,Hesek等[5]将微波技术应用于分析化学中开始,微波合成法以其独特的加热方式受到科研人员的密切关注,并进行了大量的相关研究工作.

目前,微波合成法已被广泛用于磷酸铝分子筛和硅酸铝沸石的合成中[6-8].传统的加热方式是靠辐射、对流、传导等3种方式由表及里加热,而微波加热不同于此,其具有其他合成方法不可比拟的优点:受热均匀,加热速度快,结晶迅速[7],粒径小且均匀[9-11],副反应少,产物相对单纯[12]等.最近,有报道指出,由于微波合成法结晶迅速,应用此方法可以使合成的产物孔径增大[13].因此,微波合成法是一种有效合成材料的方法.

植酸为环境友好型的分子[14],植酸 (IP6或PA)是一类天然物质,在许多植物组织,特别是在麸类和种子中,作为磷的主要存在形式.它具备一些独特的优点,如生物相容性好,无毒和对环境友好.符合当今的科研时代趋势.每个植酸分子可提供6对氢原子使自由基的电子形成稳定结构,通过研究小组前期的工作已经了解到[15-16],将一定浓度的植酸钠加热,可形成植酸胶束,用于纳米粒子的稳定剂和表面活性剂,有效地保护了纳米粒子.

辣根过氧化物酶 (Horseradish Peroxidase,HRP)是一种性质稳定,活性高、商品化较早的生物分子.它可以作为一种生物合成和转化的试剂,被广泛应用在生物传感器、废水处理、环境化学等领域,是研究最多的一种过氧化物酶.过氧化物酶在生物体内以及食物药物中有着重要影响,生物体内许多过氧化物酶参与的酶促反应的副产物是过氧化氢 (H2O2),因此通过检测过氧化氢的含量来研究过氧化物酶的动力学和热力学性质,为了解生物体内的生命现象提供了可能.在检测的众多方法中,电化学生物传感器方法可以实现对H2O2的快速、高效的检测,因此,过氧化物酶电化学传感器在H2O2的检测中发挥着重要作用.同时,随着酶固定化技术的发展和新检测方法的应用,辣根过氧化物酶传感器的检测性能不断提高,应用领域也不断拓展.

本研究尝试利用微波合成法快速合成纳米植酸钛材料,并通过FESEM表征发现它具有多孔结构.进而,运用这种材料结合混合滴涂的方法将HRP成功修饰到电极表面制备了一种过氧化氢传感器.紫外可见光谱和电化学实验结果证明了这种材料良好的生物相容性,该法制备的生物传感器表现出良好的电化学性能.

1 实验部分

1.1 实验试剂

硫酸钛 (分析纯,国药集团化学试剂有限公司)；植酸钠 (IP6,分析纯,Aldrich公司)；辣根过氧化物酶 (HRP,EC 1.11.1.7,RZ>3.0,A>250 U·mg-1,上海丽珠东风生物科技有限公司)；磷酸盐缓冲溶液 (PBS,67 mmol·L-1)由KH2PO4和Na2HPO4调配而成,不同pH的缓冲溶液用0.1 mol·L-1的NaOH与H3PO4调节得到；所有实验用水均为超纯水 (18.2 MΩ·cm).

1.2 仪 器

CHI660D型电化学工作站 (上海辰华仪器有限公司),电化学实验采用常规三电极体系:修饰电极 (自制)为工作电极,铂电极作辅助电极,饱和甘汞电极作参比电极；760CRT型紫外可见分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司)；场发射扫描电子显微镜 (FESEM)图由Hitachi S-4800型扫描电镜得；FE20型pH计 (上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；SK2200H型超声清洗器 (上海科导超声仪器有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 植酸钛纳米粒子的制备

将植酸钠 (IP6)溶液加热至沸腾,然后将硫酸钛酸性溶液 (植酸钠和硫酸钛溶液的摩尔比为1∶3)加入上述溶液中,混合均匀后转移到微波反应器中,在100℃条件下反应40 min.冷却后离心(7000 r/min),用超纯水清洗后再分散,即得到纳米植酸钛分散液.

1.3.2 修饰电极的制备

玻碳电极经砂纸打磨,超纯水超声清洗后,用0.3 μm的α-Al2O3粉末在麂皮上抛光,然后分别用超纯水、乙醇、超纯水超声清洗,用N2吹干.

首先取相同体积的植酸钛分散液和5 mg·mL-1的HRP (pH=5.5),离心管中混合均匀,然后移取3 μL混合溶液滴在处理干净的玻碳电极表面,置于冰箱中4℃下晾干,后用蒸馏水洗净,晾干,就得到了辣根过氧化物酶-植酸钛修饰的玻碳电极,将其置于4℃冰箱中储存备用.修饰电极记作HRP/Ti-IP6/GCE.另外,按相同的方法制备修饰电极Ti-IP6/GCE做对比.

1.3.3 电化学测量方法

连接三电极系统,铂电极为辅助电极,饱和的甘汞电极为参比电极,修饰电极为工作电极.向一定量的PBS (pH=7.0)溶液中通高纯氮气一定时间,以消除溶液中氧气的干扰.循环伏安实验在静止溶液中操作,而计时电流实验应在持续稳定搅拌的溶液中进行,待基线电流稳定后,加入一定量的H2O2,记录电流响应值.

2 结果与讨论

2.1 场发射扫描电子显微镜 (FESEM)表征

图1 (A)是植酸钛纳米粒子的FESEM图,(B)是植酸钛与HRP等体积混合后的FESEM图.通过FESEM比较可以看出,制备所得的植酸钛纳米粒子是形貌不规则且具有孔状结构的,当植酸钛与HRP混合后,发现形貌发生了改变,HRP在植酸钛表面上形成了一层薄膜,说明HRP很好地修饰到植酸钛上,这种结构也有助于实现直接的电子转移.

图1 Ti-IP6 (A)和HRP/Ti-IP6 (B)的FESEM图

2.2 紫外可见光谱 (UV-vis)表征

图2分别考察了植酸钛分散液、HRP以及它们的混合物的紫外可见吸收曲线.曲线 (a)是植酸钛分散液的紫外可见吸收曲线,可以看出它在300～800 nm波长范围内没有明显的吸收峰.曲线 (b)是HRP溶液的紫外可见吸收曲线,397 nm处的吸收峰归属于HRP中三价铁的Soret吸收带,而植酸钛与HRP混合溶液 (c)的紫外可见吸收曲线中,这个峰位于396 nm处,这与HRP的吸收曲线相比,只有1 nm的位移.同时,在这两条吸收曲线中,500 nm和640 nm处归属于HRP的Q和CT吸收带都存在,且峰形和峰位置完全没有改变.以上表明修饰的HRP仍然保持其原有的生物活性,也证明了植酸钛纳米材料具有一定的生物亲和性.

图2 Ti-IP6(a)，HRP(b)和HRP/Ti-IP6(c)的紫外可见光谱图

2.3 HRP在修饰电极上的直接电化学

图3是裸玻碳电极和不同修饰电极在PBS (pH=7.0)中的循环伏安曲线,从图3中可以看出,裸玻碳电极 (a)和修饰电极Ti-IP6/GCE (b)在PBS (pH=7.0)溶液中均没有观察到明显的氧化还原峰,说明植酸钛是一种非电活性的材料.而在修饰电极HRP-Ti-IP6/GCE (c)的CV曲线上有一对明显的氧化还原峰,这对氧化还原峰同样来源于HRP的血红素中FeⅢ/Ⅱ的氧化还原反应,说明HRP已成功地固定到玻碳电极表面且保持了生物电活性,同样证明植酸钛纳米粒子为HRP提供了一个良好的生物亲和界面,实现了HRP与玻碳电极间的直接电子转移.另外,当扫速为300 mV·s-1时,修饰电极的阳极峰电位Epa=-0.331 V,阴极峰电位Epc=-0.402 V,△Ep=71 mV,式量电位E0′=-0.367 V,说明该电极反应是一个准可逆反应过程.

图3 修饰电极裸GCE(a),Ti-IP6/GCE (b)和HRP-Ti-IP6/GCE(c)在PBS (pH=7.0)中的循环伏安曲线(扫速:300 mV·s-1)

2.4 修饰电极不同扫速的循环伏安曲线

图4研究了修饰电极HRP-Ti-IP6/GCE在PBS (pH=7.0)溶液中不同扫速下的循环伏安行为,以及峰电流与扫速之间的关系.由图4中发现,随着扫描速度的增加,修饰电极的氧化还原峰电流也在不断地增加,且当扫描速度在100～500 mVs-1范围内变化时,修饰电极的氧化还原峰电流与扫速成线性关系 (见图4插图),说明在该扫描速率范围内电极反应是一个表面控制的电极反应过程,并进一步证明了HRP成功固定到电极表面,保持了良好的生物活性.

图4 HRP-Ti-IP6/GCE在PBS (pH=7.0)溶液中不同扫速:100,200,300,400,500 mV·s-1下的循环伏安曲线(插图:峰电流与扫速的线性关系)

2.5 溶液pH对修饰电极的影响

利用循环伏安法研究了修饰电极的式量电位E0′与溶液pH值之间的关系,以此考察修饰电极的循环伏安行为受外部溶液pH值的影响.图5是修饰电极HRP-Ti-IP6/GCE在不同pH的PBS溶液中的循环伏安曲线.由图5可见,当PBS溶液的pH值在4～9之间改变时,循环伏安曲线的氧化还原峰电位随缓冲溶液pH值的增加而负移,并且修饰电极的式量电位E0′与溶液的pH值呈线性关系,斜率为-53 mV·pH-1(见图5插图).这一斜率值接近于伴随一个质子转移的单电子的可逆电极反应的理论值-59 mV·pH-1[17].

2.6 修饰电极对过氧化氢的电催化还原

图6是修饰电极HRP-Ti-IP6/GCE对H2O2的电催化还原行为的研究.当在PBS中加入H2O2后,

图5 不同pH值的PBS溶液中修饰电极的循环伏安曲线(插图:式量电位与pH的关系.扫速:200 mV·s-1)

修饰电极的CV曲线峰形发生了很大的改变,与未加H2O2的CV曲线 (a)相比,随着加入H2O2浓度增大,催化曲线的还原峰电流增大,氧化峰电流减小甚至消失.由此可见,修饰电极HRP-Ti-IP6/GCE对H2O2有良好的电催化还原作用,同时也进一步证明植酸钛纳米粒子保持了HRP的电催化活性.

图6 修饰电极在不含(a)及含不同浓度的H2O2(b～d)在PBS溶液 (pH 7.0)中的循环伏安曲线(扫速:200 mV·s-1)

2.7 计时电流响应

图7 HRP-Ti-IP6/GCE在PBS (pH=7.0)中连续加入H2O2的计时电流响应曲线(工作电位:-240 mV;插图:响应电流与H2O2浓度的标准曲线)

2.8 稳定性和重现性

通过循环伏安法对修饰电极HRP-Ti-IP6/GCE的稳定性进行了考察.在PBS (pH=7.0)中以200 mV·s-1进行连续100圈的循环伏安扫描,其电流响应没有明显变化.将修饰电极置于PBS (pH=7.0)中4 ℃条件下保存40 d后进行CV扫描,其响应电流为初始电流的91%,表明制备的传感器有良好的稳定性.

利用计时电流法考察了修饰电极的重现性.结果显示:该修饰电极对1 μmol·L-1H2O2溶液重复5次测定的相对标准偏差 (R.S.D.)是2.85%.3支相同方法制备的修饰电极,在同一条件下对1 μmol·L-1H2O2的电流响应的R.S.D.为3.0 %,说明该传感器有良好的重现性.

3 结 论

利用植酸盐分子中磷酸基团与部分金属离子的强络合能力,通过微波合成法合成了新颖的植酸钛纳米材料,并运用这种材料结合混合滴涂的方法将HRP成功修饰到固定到玻碳电极表面.紫外可见光谱和电化学实验结果证明了这种材料良好的生物相容性,有利于防止酶在固定化过程中生物活性的损害.此法制备的生物传感器实现了HRP和玻碳电极之间的直接电子转移,且对过氧化氢呈现出良好的电催化还原作用,同时具有良好的稳定性和重现性.

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