溶藻细菌MT22的形态学观察和分子鉴定

陈 敏，贾瑞亨

（杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州310036）

近十年来，随着经济的迅速发展，越来越多的生活、工业、农业污水被排放到江河流域中，直接造成自然界水体的富营养化，进而爆发“藻类水华”，严重影响社会和经济的可持续发展［1-3］.水体的富营养化将是中国今后相当长一段时期内的重大水环境问题，寻求有效的水华防治方法势在必行［4-6］.

笔者前期分离获得一株具有高效溶藻效果的溶藻细菌MT22（研究结果另文报道），本文结合形态学观察、生理生化鉴定以及16S r RNA 基因测序的方法对其进行菌种的鉴定，以期为溶藻细菌在生物控藻方面的应用提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 藻种

铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa），培养条件为：25±0.5 ℃，光照强度2 000～2 500 lx，光暗周期比14 h∶10 h.

1.2 菌种

溶藻细菌MT22：由本实验室从养殖塘底泥中分离得到，并经前期实验证明有较强溶藻效果.37 ℃培养箱培养后于4 ℃冰箱中保存，以供后续实验使用.

1.3 培养基

LB培养基：胰蛋白胨10.0 g／L，NaCl 10.0 g／L，琼脂15.0 g／L，酵母提取物5.0 g／L，p H 为7.2～7.4.

BG11培养基：NaNO31.5 g／L，K2HPO40.04 g／L，MgSO4·7H2O 0.075 g／L，CaCl2·7H2O 0.036 g／L，Na2CO30.02 g／L，柠檬酸0.006 g／L，柠檬酸铁0.006 g／L，微量元素溶液A5 1 m L，氨苄青霉素50 g／L，琼脂20 g／L，p H7.1.

1.4 形态学观察

1.4.1 菌落观察 取试管斜面保藏的菌种少许，在LB固体平板培养基上划线，倒置在37 ℃培养箱中培养2 d，观察平板上单菌落的形态特征，包括颜色、大小、形状、边缘、表面突起及透明程度等［7］.

1.4.2 菌体形态观察 挑取少许菌苔，经涂片、干燥、固定、染色、水洗、干燥后置于显微镜下观察细菌的形态、大小等，并记录［7］.

1.4.3 革兰氏染色 涂片方法同上.革兰氏染色用结晶紫初染90 s，水洗，滴加卢戈氏（Lugol's）碘液冲去残水，覆盖1 min，水洗，95%的乙醇滴洗，直至流出的液体不呈紫色，约20～30 s，立即水洗，0.5% 番红水溶液复染1～2 min，水洗，晾干后镜检.呈紫色的为革兰阳性菌，呈红色的为革兰阴性菌［7］.

1.4.4 芽孢染色 按常规方法取少许菌苔涂片、干燥及固定，滴加5%孔雀绿水溶液加热染色5 min，水洗，0.5%番红水溶液复染2 min，水洗至无色，待载玻片晾干后油镜镜检［7］.

1.5 生理生化试验

根据形态鉴定结果，选择合适的测试鉴定卡，按照VITEK®2 COMPACT 全自动微生物分析系统仪器说明书中的标准操作流程进行［8］.

1.6 16S r RNA 基因测序

1.6.1 基因组DNA 的提取 采用细菌基因组提取试剂盒方法（生工生物公司SK8226）.

1.6.2 PCR 扩增 采用细菌16S r RNA 通用引物P0和P6，上游引物P0：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物P6：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'.

PCR 反应程序：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min（30个循环），72 ℃充分延伸20 min.

1.6.3 基因测序 将PCR 产物回收.PCR 产物的纯化、克隆和测序由上海英俊生物技术有限公司完成.

1.6.4 序列同源性比较 测序结果提交到GenBank得到基因序列登录号.通过在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索，找出该株菌与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏在ATCC、DSM等国际菌种保藏中心的菌株.

2 结果与分析

2.1 形态学观察

MT22溶藻细菌在固体LB培养基上形成的菌落呈白色，形状为圆形，较小，菌落干燥、表面扁平、边缘呈褶皱状、质地致密（图1）.

菌体形态为杆状（图2），菌体大小为4.1μm×1.0μm.革兰氏染色阳性，菌体中有芽孢（图3）.

图1 MT22菌落形态Fig.1 Colony morphology of strain MT22

图2 MT22菌体形态Fig.2 Cell morphology of strain MT22

图3 芽孢染色Fig.3 Spore staining

2.2 生理生化反应鉴定

经VITEK®2 COMPACT（全自动微生物分析仪）分析，MT22溶藻细菌的生理生化指标如表1 所示，鉴定报告中显示结果为：解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens），94%可能性.

表1 MT22菌株生理生化试验Tab.1 Morphophysiological characteristics of strain MT22 by VITEK®2 COMPACT tests

2.3 16S r RNA 基因测序

扩增MT22菌株的16S r RNA 基因序列，将PCR 产物进行序列测定，测序结果提交到GenBank，得到基因序列登录号为JQ859918.Blast比对结果表明，菌株MT22与解淀粉芽孢杆菌BacillusamyloliquefaciensRx-35（JN086147.1）的同源性达99%.

综合以上结果，初步鉴定MT22菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）.

3 讨 论

20世纪80年代之前，细菌的分类和鉴定主要依靠形态学特征、培养特征、生理生化特征和免疫学反应进行.这些方法在细菌分类鉴定中发挥过重要作用，但也存在着鉴定准确性差、繁琐耗时等缺点.随着分子生物学的发展，细菌的鉴定开始进入分子水平，其中，16S r RNA 基因的同源性分析已经成为细菌种属鉴定的标准方法，在细菌的分类研究中起着重要的作用［9］.细菌的16S r RNA 序列长约1.6 kb左右，其序列变化速度与进化速率相适应，因此被广泛用于种属鉴定［10］.随着测序技术的发展，越来越多的微生物的16S r RNA 序列被收入基因数据库，这使得用16S r RNA 测序分析鉴定细菌更加快捷方便.

VITEK®2 COMPACT 是生物梅里埃公司集合多年的微生物鉴定经验，于2005年推出的一代新的微生物鉴定智能系统，为快速、正确的细菌学报告创造了物质基础，使得细菌检验水平获得了质的飞跃［11］.在细菌检验中以自动化系统代替传统的手工操作是当代临床检验进步的标志之一.

解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌.最近几年大量学者研究发现，解淀粉芽孢杆菌在自然生长过程中可以产生抗菌物质，能够强烈抑制多种细菌和真菌，如可以抑制镰刀菌、曲霉、青霉、毛霉等引起食品腐败的真菌［12］，抑制多种病原菌如李斯特菌的生长，有些解淀粉芽孢杆菌还对大豆根腐病菌有很高的抑菌率［13］.目前对于解淀粉芽孢杆菌在溶藻方面的研究还比较少.

本研究以细菌16S r RNA 一对通用引物，对MT22菌株进行16S r RNA 序列同源性分析.扩增结果与GeneBank上的标准序列进行比对，结果显示，MT22 菌株与解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）序列比较同源性为99%.为了进一步证实鉴定结果，进行了生理生化鉴定，结果表明，其主要特征与解淀粉芽孢杆菌吻合.因此，初步鉴定MT22菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）.

［1］邓建明，陶勇，李大平，等.溶藻细菌及其分子生物学研究进展［J］.应用与环境生物学报，2009，15（6）：895-900.

［2］康升云，胡川.藻类水华的生物控制措施［J］.福建水产，2010（2）：85-88.

［3］李英，蒋固政.水华成因分析和防治措施研究进展［J］.环境科学与工程，2009（12）：15-20.

［4］彭超，吴刚，席宇，等.3株溶藻细菌的分离鉴定及其溶藻效应［J］.环境科学研究，2003，16（1）：37-40.

［5］吴刚，席宇，赵以军.溶藻细菌研究的最新进展［J］.环境科学研究，2002，15（5）：43-46.

［6］李超，吴为中，吴伟龙，等.解淀粉芽孢杆菌对鱼腥藻的抑藻效果分析与机理初探［J］.环境科学学报，2011，31（8）：1602-1608.

［7］陈敏.微生物学实验［M］.杭州：浙江大学出版社，2011.

［8］王原，许江燕.VITEK-2 compact全自动微生物鉴定仪对葡萄球菌鉴定能力的评价［J］.生物医学工程学进展，2010，31（4）：206-208.

［9］Vandamme P，Pot B，Gillis M，etal.Polyphasic taxonomy，a consensus approach to bacterial systematics［J］.Microbiological Reviews，1996，60（2）：407-438.

［10］Olsen G J，Larsen N，Woese C.The ribosomal database project［J］.Nucleic Acids Res，1997，25：109-110.

［11］付礼霞，孙铁军，冯念伦.全自动微生物鉴定和药敏分析仪器的探讨［J］.中国医学装备，2005，2（10）：51-52.

［12］王军华，权春善，徐洪涛，等.解淀粉芽孢杆菌Q-12抗真菌特性的研究［J］.食品与发酵工业，2006，32（6）：47-50.

［13］Sutyak K E，Wirawan R E，Aroutcheva A A，etal.Isolation of theBacillussubtilisantimicrobial peptide subtilosin from the dairy product-derivedBacillusamyloliquefaciens［J］.Journal of Applied Microbiology，2008，104（4）：1067-1074.