罗非鱼副产物对米曲霉产酶及蛋白质转化的影响

张红杰 刘小玲 刘伯科 秦 溪

（广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004）

鱼露是一种风味独特的水产调味料，其液体清澈为琥珀色，具有独特的鲜味，富含必需氨基酸、多种矿物元素和维生素，营养价值高［1］。泰国、越南、中国等［2］是鱼露的主要生产和消费国家，中国则主要集中在东南沿海，如［3］潮汕、福州等地。鱼露主要是以低值小鱼虾或水产品加工下脚料为原料［4］，经25%～30%的盐腌渍，在自然或恒温条件下，利用鱼体自身的组织蛋白酶的酶解自溶作用，将大分子的鱼体蛋白质水解成小分子的多肽、氨基酸；再在嗜盐微生物的作用下，产生各种鲜味氨基酸及风味物质的调味酱汁，一般发酵周期在1～3年之间［5］。

酱油因其独特的风味和丰富的营养成分，已成为中国及东亚国家重要的调味品。它主要是以大豆、小麦、麸皮为基本原料，通过米曲霉前期制曲产酶，后期加盐加水发酵，在米曲霉分泌的蛋白酶、淀粉酶等共同作用下，使大分子的蛋白质、淀粉等营养物质，水解成小分子的多肽、氨基酸、葡萄糖等其他的营养和风味物质。

将鱼露的原料—水产动物蛋白添加到传统的酱油原料豆粕中，利用酱油酿造的菌种米曲霉的代谢产生的蛋白酶，将动植物蛋白转化为呈味肽和其他小分子物质，缩短发酵周期［6］，获得一种具有香甜味，没有明显腐臭味和鱼腥味［7］，呈现显著鲜味的复合发酵制品是本课题的目的和出发点。本研究拟探究添加罗非鱼鱼排进行混合制曲对米曲霉产酶能力的影响，以及鱼排不同的添加方式对后续固态发酵制品品质的影响，从而为提高混合制曲酶活力，加快原料蛋白水解，提高原料利用率和增加鱼酱油的品质奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

罗非鱼鱼排：南宁市百洋水产有限公司；

豆粕、麸皮、小麦：南宁市白苍岭市场；

GIM 3．451米曲霉：广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心；

凯式定氮仪：KDN－04A 型，丹麦Foss公司；

电子天平：FA－1004型，瑞士Mettler Toledo公司；

自动高压灭菌锅：YX280A 型，上海三申医疗器械有限公司；

恒温发酵箱：PYX－250H－C型，广东省医疗器械厂；

分光光度计：722N 型，上海菁华科技仪器有限公司。

1．2 试验方法

1．2．1 菌种培养 将GIM 3．451米曲霉菌种接种到PDA试管斜面培养基，28 ℃下恒温培养2～4d，待试管内长满黄绿色孢子即可。再转移到三角瓶扩培（培养条件同试管培养），得到种曲。

1．2．2 鱼、豆混合制曲 豆粕、麸皮、小麦等是传统酱油酿制的主要原料，通过前期研究得出了以豆粕为主要氮源，小麦和麸皮作为主要碳源，制曲的最佳原料配比为豆粕、麸皮、小麦按6∶3∶1添加，水添加量为原料质量的110%。本研究在不改变总体碳氮比的基础上，通过加入鱼排替代一定比例的豆粕，进行混合制曲（鱼、豆混合制曲），研究鱼排的加入对制曲蛋白酶活力的影响。

1．2．3 低盐固态发酵 前期研究得出鱼排经切碎、蒸煮、冷却后加酱油曲发酵制备鱼酱油（鱼后期添加）的最优原料配比为成曲和鱼排（湿计）按8∶4添加，水的添加量为成曲和鱼排总质量的40%，酱醪盐度为5%，发酵温度为50 ℃。鱼、豆混合制备的成曲由于水分含量较低（30%～40%），为保证相同条件下发酵，水分添加量为成曲质量的80%，其它条件与加曲发酵制备鱼酱油条件相同。

根据GB 18186—2000，酱油中氨基酸态氮含量是酱油的营养价值的体现，蛋白水解率可直观的反应出原料的利用率，总酸值为重要的滋味指标，铵盐是酱油安全品质的一个重要体现之一。本试验通过测定混合制曲、豆粕制曲及鱼排后期酱醪中氨基酸态氮、蛋白水解率、铵盐随时间的变化，比较3种发酵工艺之间的差异。

1．2．4 测定方法

（1）制曲原料的化学成分测定：蛋白质和总氮的测定，参照GB 5009．5—2010；粗脂肪的测定，参照GB／T 5009．6—2003；粗淀粉的测定，参照GB／T 5009．6—2008；水分含量的测定，参照GB／T 9695．15—2008；灰分的测定，参照GB／T 5505—2008（豆粕、小麦、麸皮）和GB／T 9695．18—2008（鱼排）。

（2）蛋白酶活力的测定：参照SB／T 10317—1999 的福林酚法。

根据SB／T 10317—1999的测定方法，制定的标准曲线如图1所示，其中酪氨酸浓度与吸光值（OD660nm）的线性回归方程：

式中：

Y——酪氨酸浓度，μg／mL；

X——吸光值（OD660nm）；

其中R2＝0．999 8，说明线性相关性良好。

图1 蛋白酶活力标准曲线图Figure1 Protease activity standard curve

（3）酱醪中氨基酸态氮的测定：参照GB／T 5009．39—2003中甲醛滴定法。按式（1）计算氨基酸态氮的百分含量：

式中：

PA——酱醪中氨基酸态氮的百分含量，%；

AN——酱醪中氨基酸态氮的含量，g；

M——酱醪的干重，g。

（4）蛋白水解率测定：参照何雪莲的测定方法［8］。按式（2）计算蛋白水解率：

式中：

DH——蛋白水解率，%；

AN——发酵后酱醪中氨基酸态氮含量，g；

AN0——发酵前酱醪中氨基酸态氮含量，g；

TN——发酵前酱醪中总氮含量，g。

（5）铵盐的测定：参照GB／T 5009．39—2003 的半微量定氮法。按式（3）计算酱醪中铵盐的百分数：

式中：

PT——酱醪中铵盐的百分数，%；

SN——酱醪中铵盐的质量，g；

M——酱醪的干重，g。

1．2．5 数据分析 所有样品进行3组平行试验，数据采用SPSS软件进行差异性分析（ANOVA），P＜0．05 表示存在显著差异，使用Origin 8．0软件进行绘图。

2 结果与分析

2．1 制曲原料的基本化学组成

制曲原料的化学物质为米曲霉的生长提供必要的营养，同时也是酱油营养和风味的来源。几种主要原料的基本组成见表1，其中豆粕粗蛋白含量最高，且价格低廉，是目前酱油发酵的主要氮源，而罗非鱼鱼排粗蛋白含量高达36%（干基计折算后），与豆粕蛋白质含量接近，可作为良好的氮源。小麦和麸皮淀粉含量较高，是酱油发酵的良好碳源，而且淀粉质原料是形成酱油中葡萄糖、酒精、甘油、脂类物质的主要原料等，直接影响到酱油的成色和风味；而且麸皮疏松，便于通风，有利于米曲霉生长，提高酶活。鱼排的水分和油脂含量较高，如果单独采用鱼排制曲，米曲霉生长缓慢，同时也容易污染杂菌［9］。如用鱼排和豆粕混合制曲，则可有望解决鱼排单独制曲的不足，同时鱼排中灰分含量高，如采用混合制曲，通过后期发酵制备鱼酱油，鱼骨中的钙可与产品中乳酸、氨基酸等结合，从而提高产品中的钙离子含量。

由于罗非鱼鱼排水分含量高达60%，其干基蛋白质含量与豆粕相近，故后期试验鱼排添加量折算成干基量，实际湿计添加量为干基的两倍。

2．2 鱼排的替代量对米曲霉产酶活力的影响

在制备成曲过程中，米曲霉主要产生中性、碱性、酸性3种蛋白酶，但是随着发酵的进行，酱醪pH 下降，碱性蛋白酶酶活受到抑制，本试验选用酸性、中性蛋白酶酶活作为测定指标。

由于鱼排水分含量高，不同鱼排替代量，对应的水分添加量也不一样，故在相同外界条件下进行试验，结果见图2。由图2可知，随鱼排（干基）替代量逐步增加，成曲中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力都呈下降趋势，但1／6～1／3的豆粕被鱼排替代时，中性和酸性蛋白酶酶活力下降不显著（P＜0．05）。因此鱼排替代部分豆粕作为氮源，最高不应大于豆粕总量的1／3。

2．3 润水量对米曲霉产酶活力的影响

由于罗非鱼鱼排的水分含量接近60%，鱼排的添加使得原料的水分含量增加，外加水量下降。由图3可知，随着润水量的增加，中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力都是先增加后降低，当润水量在40%和50%时中性蛋白酶和酸性蛋白酶活力达到较优值，且无明显差异，由于高水分会抑制米曲霉的生长，容易感染杂菌，出现坏曲［9］的情况，故选择40%的润水量进行后期发酵制曲。

表1 制曲原料的基本化学组成Table1 Composition of starter－making raw material（n＝3，X±SD） ／%

图2 鱼排替代豆粕量对米曲霉产酶活力的影响Figure2 Effect of substitute ratio of soybean by fish ribs on the protease activity of Aspergillus oryzae

图3 润水量对米曲霉产酶活力的影响Figure3 Effect of water content on the protease activity of Aspergillus oryzae

2．4 米曲霉接种量对米曲霉产酶活力的影响

米曲霉接种量后于28 ℃恒温培养72h，比较米曲霉接种量对米曲霉产酶活力的影响。由图4可知，随着接种量的增加，两种蛋白酶活力均呈上升趋势，当接种量为4×106CFU／100g时，两种酶的酶活达到最大值。但接种量为3× 106CFU／100g和4×106CFU／100g 时，对酶活力影响无显著差异，故选用3×106CFU／100g为最适接种量。

图4 米曲霉接种量对米曲霉产酶活力的影响Figure4 Effect of original spores on the protease activity of Aspergillus oryzae

2．5 制曲过程中米曲霉产酶活力的变化

罗非鱼排添加并部分替代豆粕制曲，对米曲霉生长和产中性蛋白酶和酸性蛋白酶有一定的抑制作用，但是鱼排替代豆粕比例在1／3以内时，对中性和酸性蛋白酶活力的影响较小，同时也发现鱼、豆混合制曲的润水量为40%，接种量为3×106CFU／100g时获得最高的酶活力。以豆粕、麸皮、小麦三者原料配比6∶3∶1，润水量110%为对照组与鱼排替代1／3豆粕量，润水量40%，接种量3×106CFU／100g，对鱼、豆混合制曲随时间变化进行比较，测定指标为中性蛋白酶，酸性蛋白酶活力（干基）。由感官观察发现在制曲后36h，米曲霉生长缓慢，菌丝较少，故从36h开始，每隔12h测定一次，测定结果见图5。

图5 中性蛋白酶活力在两种制曲方式中随时间的变化Figure5 Neutral protease activity changes over time of two starter－making ways

由图5 可知，豆粕单独制曲过程中中性蛋白酶活力在60h和72h之间无明显差异，且达到较优值；鱼豆混合制曲在72h时中性蛋白酶活力达到最大值，其中鱼、豆混合制曲（1 710U／g）大于豆粕单独制曲（1 559U／g）。

由图6可知，豆粕单独制曲与鱼、豆混合制曲过程中酸性蛋白酶活力均在72h达到较优值，且豆粕制曲（179U／g）与鱼、豆混合制曲（148U／g）相差不大。

图6 酸性蛋白酶活力在两种制曲方式中随时间的变化Figure6 Acid protease activity changes over time of two starter－making ways

综上可知，鱼、豆混合制曲的最佳原料配比为鱼排（干基）、豆粕、麸皮、小麦按2∶4∶3∶1进行添加，接种量为3×106CFU／100g，水分添加量为原料质量的40%，发酵时间为72h时可获得较优中性蛋白酶（1 710U／g）和酸性蛋白酶活力（148U／g），从而为后期酱醪发酵加速底物的水解创造了条件。同时与鱼排粉碎酶解后，进行液体制曲［8］相比，具有操作简单，蛋白酶活高等优点。

2．6 鱼排的两种添加方式对蛋白水解率的影响

根据GB 18186—2000，酱油中氨基酸态氮含量是酱油的营养价值的体现，蛋白水解率可直观的反应出原料的利用率，铵盐是酱油安全品质的一个重要体现之一，铵盐过高，影响人的肝、肾功能，诱发心脏病，增加患癌的危险［10，11］。本试验以豆粕为主要氮源，进行制曲作为对照组。通过氨基酸态氮含量，蛋白水解率及铵盐含量来比较鱼排和豆粕混合制曲以豆粕制曲鱼排后期添加两种发酵工艺之间的差异。

由图7可知，在发酵10～15d时，豆制曲酱醪（对照组）和鱼、豆混合制曲酱醪中氨基酸态氮含量达到较优值，分别为2．50%（干基）和3．80%（干基）左右；鱼排在发酵期添加，则酱醪中氨基酸态氮在10～15d 时达到较优值，含量为2．78%（干基）左右；鱼排在成曲制备阶段加入和发酵阶段加入相比，前者的酱醪中氨基酸态氮比后者显著提高，说明鱼排适合在成曲制备阶段添加，且鱼排适当替换一定比例的豆粕，可有效增加发酵酱醪的氨基酸态氮含量。

由图8可知，鱼、豆混合制曲酱醪和豆制曲酱醪（对照组）在发酵10～15d时，蛋白水解率达到较高值分别为58%和45%左右；鱼后期添加在发酵10～15d时，酱醪蛋白水解率达最大值52%；由上可知鱼、豆混合制曲酱醪比鱼后期添加酱醪具有更好的原料利用率。由图5、6可知，鱼、豆混合制曲和豆制曲蛋白酶活差异不大，而鱼、豆混合制曲酱醪比豆制曲酱醪的蛋白水解率高，说明在同样酶系酶活条件下鱼肉蛋白比豆粕蛋白更容易水解。

图7 3种发酵工艺中氨基酸态氮随时间的变化Figure7 Amino acid nitrogen changes over time in the three kinds of fermentation process

图8 3种发酵工艺中蛋白水解率随时间的变化Figure8 Protein hydrolysis efficiency changes over time in the three kinds of fermentation process

图9 3种发酵工艺中铵盐随时间的变化Figure9 Ammonium salt changes over time in the three kinds of fermentation process

由图9可知，随着发酵时间的推移，铵盐先增加后减少，这是由于发酵过程中微生物的脱氨基作用及蛋白水解过程［10］中产生的小分子氨使得酱醪中铵盐增加，随着时间的延长，由于采用中温发酵，在温度较高的情况下铵盐会分解挥发从而下降［12］。在3种发酵工艺中，豆制曲酱醪中铵盐为最低，鱼、豆混合制曲酱醪比鱼排后期添加酱醪铵盐要低，由此可知鱼肉蛋白的添加会滋生腐败菌，从而增加了铵盐的含量，但是鱼、豆混合制曲与豆制曲相差不大，是生产鱼酱油比较卫生安全的一种发酵方式。然而鱼排后期添加采用加曲发酵方式的酱醪铵盐含量较高，故很多研究者进行加曲发酵时，一般采用高盐稀态发酵的方式［8，13］，从而抑制腐败菌的滋生。

3 结论

罗非鱼鱼排蛋白含量高达36%（干基计）与豆粕接近，可作为蛋白质原料制备鱼露或复合发酵制品。鱼排在成曲制备阶段，以一定比例添加到原料中替换一部分豆粕，会影响米曲霉的生长及分泌酶的活力，但在1／3的替代率下，对米曲霉中性和酸性蛋白酶活力影响不显著。将鱼排与豆粕混合制备复合发酵制品，相同添加量下，鱼排在成曲制备阶段加入，经过低盐固态发酵一段时间，其酱醪的氨基酸态氮、蛋白水解率均显著高于纯豆粕氮源酱醪的氨基酸态氮、蛋白水解率含量，而酱醪中铵盐，虽比纯豆粕的高，但显著低于鱼排后期添加的样品。综合比较，说明鱼排添加可以有效提高发酵制品的呈味组分氨基酸态氮，且在成曲制备阶段加入为宜。

1 Gustaf Helgi Hjalmarsson，Jae W Park，Kristberg Kristbergsson．Seasonal effects on the physicochemical characteristics of fish sauce made from capelin （Mallotus villosus）［J］．Food Chemistry，2007，103（2）：495～504．

2 Muhammad Zukhrufuz Zaman，Fatimah Abu Bakar，S Jinap，et al．Novel starter cultures to inhibit biogenic amines accumulation during fish sauce fermentation［J］．International Journal of Food Microbiology，2011，145（1）：84～91．

3 Jin－Jin Jiang，Qing－Xiao Zeng，Zhi－Wei Zhu，et al．Chemical and sensory changes associated Yu－lu fermentation process－a traditional chinese fish sauce［J］．Food Chemistry，2007，104（4）：1 629～1 634．

4 Wei Xu，Gang Yu，Chang－hu Xue，et al．Biochemical changes associated with fast fermentation of squid processing by－products for low salt fish sauce［J］．Food Chemistry，2008，107（4）：1 597～1 604．

5 肖宏艳，王海燕，蔡永洪，等．超声波处理对加酶发酵鱼露的影响［J］．食品与机械，2013，29（4）：14～19．

6 Chuenjit Chancharoonpong，Pao－Chuan Hsieh，Shyang－Chwen Sheu．Enzyme production and growth of Aspergillus oryzae S．on soybean Koji fermentation［J］．APCBEE Procedia，2012，2：57～61．

7 Anupam Giri，Kazufumi Osako，Akira Okamoto，et al．Olfactometric characterization of aroma active compounds in fermented fish paste in comparison with fish sauce，fermented soy paste and sauce products［J］．Food Research International，2010，43（4）：1 027～1 040．

8 何雪莲．罗非鱼加工下脚料发酵生产鱼露的研究［D］．海口：华南热带农业大学，2007．

9 孙美琴．鱼露的风味及快速发酵工艺研究［J］．现代食品科技，2006，22（4）：280～283．

10 李卫东．酱油中按盐的形成途径及防止办法［J］．中国调味品，2001（8）：25～27．

11 Muhammad Zukhrufuz Zaman，Fatimah Abu Bakar，Jinap Selamat，et al．Degradation of Histamine by the halotolerant Staphylococcus Carnosus FS19isolate obtained from fish sauce［J］．Food Control，2014，40：58～63．

12 辛若竹，肖金艳，郭赫宇，酿造酱油生产过程中铵盐含量超标的处理方法［J］．中国调味品，2006（6）：28～31．

13 Ing－Lung Shih，Lien－Guei Chen，Ton－Shi Yu，et al．Microbial reclamation of fish processing wastes for the production of fish sauce［J］．Enzyme and Microbial Technology，2003，33（2～3）：154～162．