A1蛋白与前列腺特异性抗原在前列腺癌与前列腺增生疾病中联合检测的意义

马增煌

A1蛋白与前列腺特异性抗原在前列腺癌与前列腺增生疾病中联合检测的意义

马增煌

目的选取50～70岁之间的前列腺增生、前列腺癌患者和健康对照者，对其血液中A1蛋白的表达与PSA的表达水平进行比较分析，为前列腺增生和前列腺癌的临床鉴别诊断提供依据。方法采用电化学发光仪检测PSA浓度，采用反转录酶⁃聚合酶链锁反应（RT⁃PCR）技术和蛋白免疫印迹法（western⁃blot）检测20例前列腺癌患者、20例前列腺增生患者和20例正常者新鲜前列腺组织中A1mRNA和蛋白的表达情况，探讨A1蛋白表达与前列腺增生和前列腺癌中PSA表达水平的关系。结果RT⁃PCR与westem⁃blot检测结果一致，A1蛋白在前列腺增生组织和前列腺癌组织中均有阳性表达，前列腺癌组织中A1蛋白阳性表达明显高于前列腺增生组织，有显著性差异（P＜0.01）。A1蛋白表达的阳性率与PSA的浓度相关。结论A1蛋白阳性表达程度与前列腺病变程度相关，A1蛋白在细胞凋亡调节中起着重要的作用，其过度表达在前列腺癌的发生、发展中扮演着重要的角色。联合检测A1和PSA的表达变化对判断前列腺癌的生物学行为有参考价值。

前列腺癌；前列腺增生；前列腺特异性抗原；A1蛋白

由男性重要的性腺器官前列腺引起的疾病在不同的年龄阶段有不同的特点，老年人则多为前列腺增生（benign prostate hyperplasia BPH）及前列腺癌（prostate cancer），随着年龄的增加，前列腺癌的发病率呈明显增加的趋势，前列腺癌是男性泌尿生殖系最常见的肿瘤。应用前列腺特异抗原（prostatic specific antigen，PSA）进行大规模前列腺癌筛查，是目前早期诊断前列腺癌的最有效方法。但其对前列腺癌的早期诊断仍有一定困难和偏差，容易漏诊。分子生物技术的发展已经证明前列腺癌的发生和发展是多种癌基因和抑癌基因共同作用的结果，我们可以从蛋白水平和基因水平检测前列腺癌。本实验通过检测A1蛋白的表达水平和PSA的浓度，以探讨A1蛋白和PSA与前列腺癌和前列腺增生的相关性。

1 资料与方法

1.1 标本来源 组织标本：收集黄石市中心医院病理科2010～2013年前列腺标本，患者年龄50～70岁，平均患者（62.7±0.31）岁，前列腺癌组织标本（n＝20），前列腺增生组织标本（n＝20），正常组前列腺组织标本（n＝20），液氦保存。

血液标本：无抗凝的采血管采集肘静脉全血4ml，室温静置1 h凝固，然后4℃，2000 r／min离心10min，取出上层血清，分装于聚丙烯EP管中，－80℃冰箱保存待测。

1.2 主要试剂 RPMI1640培养液、小牛血清购自Gibco公司；Trizol、引物购自Invitrogen公司；反转录酶⁃聚合酶链反应（RT⁃PCR）试剂盒购自TOYOBO公司；100 bp DNA Ladder购自天为时代；蛋白抽提试剂盒购自Pierce公司；丙烯酰胺、N，N′⁃甲叉双丙稀酰胺、TEMED、Tris、SDS、过硫酸铵、甘氨酸购自Promega公司；PVDF膜，BSA，BLAST试剂盒购自Perkin Elemer公司；鼠抗人A1单克隆抗体购自日本MBL公司；羊抗鼠IgG／HRP购自美国Proteintech Group公司，内参anti⁃β⁃actin／HRP购自北京博奥森公司；化学发光试剂盒购自Roche公司。

1.3 PSA浓度的检测 使用德国罗氏P800全自动生化分析仪检测血清中的PSA浓度，采用电化学发光方法，标本均为同批测定，以上检测均受控于卫生部临检中心、湖北省临检中心的室间质评。

1.4 细胞培养 以含10%胎牛血清的1640培养基，于37℃、5%CO2孵箱内培养，每2～3 d传代1次。

1.5 A1 mRNA表达

1.5.1 引物设计：应用计算机软件设计引物序列为：β2微球蛋白：正义链：5’⁃CTC ACG TCA TCC AGC AGA GA⁃3’，反义链：5’⁃CAA GCT TTG AGT GCA AGA GA⁃3’，目的扩增产物长度为629 bp；A1：正义链：5’⁃TACAGGCTGGCTCAGGACTAT⁃3’，反义链：5’⁃GATGCCGTCTTCAAACTCCTT⁃3’，目的扩增产物长度为222 bp。

1.5.2 RT⁃PCR cDNA的制备：在20μl反转录反应体系中进行反转录（1μl AMV反转录酶，0.5μl RNase抑制剂，Random primer 1μl，3μl底物混合物）。反应条件为：30℃10min；42℃20min；99℃5min；4℃5 min。PCR扩增：分别加2种引物在50μl PCR反应体系中进行同管扩增（94℃2 min，1个循环；94℃15 s；52℃30 s；72℃延伸30 s；30个循环）。PCR产物用2%琼脂糖凝胶，加入10μl扩增产物，150 V 25min电泳分离，紫外光下对凝胶进行拍照，底片光密度扫描。

1.6 蛋白质的提取和鉴定

1.6.1 总蛋白的提取：取培养12 h的细胞，1500 r／min离心5 min，加入细胞裂解液（8 mol／L尿素，40 g／L CHAPS，2 mmol／L TBP，2 m l／L Bio⁃Lyte），吹打均匀，4℃振摇30 min，收集细胞裂解液于EP管中，4℃2000 r／min离心1 h，取上清液用Bradford法行蛋白定量。

1.6.2 蛋白免疫印迹法（western⁃blot）检测A1蛋白的表达：PVDF膜与鼠抗人A1单克隆抗体（1∶1000）室温育膜60min；PBST缓冲液洗膜10min×3次；HRP标记抗鼠二抗（1∶5000）育膜60 min，洗膜。将PVDF膜置于化学反应液中5 min进行显色，取出，洗净膜，将其放置荧光化学发光图像分析仪中进行曝光，采用Quantity⁃one分析系统检测蛋白条带的平均密度值，分析目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学处理 所有结果均取自1次代表性实验，结果被3次独立实验所证实。所测计量资料用均数±标准差（s）表示，以SPSS 13.0统计软件进行处理，2组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 前列腺增生组、前列腺癌组和正常组血液中PSA水平比较 正常组PSA水平在正常范围内，平均浓度为（1.09±0.17）μg／L；前列腺增生组PSA平均浓度为（8.75±0.32）μg／L，45%患者PSA水平集中在4～10 μg／L范围内；前列腺癌组PSA平均浓度为（14.68± 1.02）μg／L，55%患者PSA水平集中在10～20μg／L。与正常组比较，前列腺增生组和前列腺癌组PSA水平显著增高（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 不同PAS浓度范围内各组所占人数对比（n＝20）

2.2 A1 mRNA的表达 在正常组、前列腺增生组和前列腺癌组中，A1 mRNA均表达，PSA浓度在4～10 μg／L时，A1mRNA在前列腺增生组和前列腺癌组的表达差异有统计学意义（P＜0.05）；PSA浓度在10～20 μg／L时，A1 mRNA在前列腺癌组中的表达明显高于正常组、前列腺增生组和PSA为4～10μg／L的前列腺癌组，差异具有显著性（P＜0.01）（图1）。

2.3 A1蛋白的表达 A1蛋白的表达与PCR显示的结果相一致，当PSA浓度在10～20μg／L时，A1蛋白表达的强弱与PSA的浓度呈正相关（图2）。

图1 RT⁃PCR检测A1 mRNA

图2 Westem⁃blot检测A1蛋白的表达

3 讨论

3.1 PSA在前列腺疾病中的意义 PSA是由前列腺上皮细胞分泌产生的一种丝氨酸蛋白酶，直接分泌到前列腺导管系统内，它的正常功能是帮助精液凝块水解液化，与男性生育功能有关［1］。正常的前列腺导管系统周围存在血⁃上皮屏障，避免前列腺上皮产生的PSA直接进入血液之中，从而维持了血液中PSA的低浓度。一般认为，血清PSA浓度＜4 ng／m l为正常，＞10 ng／m l则患前腺癌的危险性增加。当前列腺发生癌变时可破坏血⁃上皮屏障，同时癌细胞分泌的PSA增多，致使更多的PSA直接进入血液内［2］。目前临床用于前列腺癌诊断最广泛的分子标志物是PSA，在临床上已将其作为前列腺癌一个重要的筛查指标［3］。大多数前列腺癌病人血清PSA水平超过正常值，PSA提高了低分级、小病灶的早期发现与诊断。但它并不是一个特异性的肿瘤标记物，当其浓度在4～10μg／L时存在一定假阴性、假阳性的病例［4⁃5］。

3.2 A1在肿瘤中的作用 Bcl⁃2是细胞凋亡过程中的一类调节因子，此基因家族包含两类功能相反的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因Bcl⁃2、Bcl⁃XL、Bcl⁃w、Bfl⁃1、Brag⁃1、Mcl⁃1和A1等，另一类是促进细胞凋亡的基因Bax、Bak、Bok、Bcl⁃Xs、Bad、Bid、Bik、Blk和Hrk等。A1基因是造血细胞在粒⁃巨噬细胞集落刺激因子和脂多糖诱导下产生的早期反应基因，与Bcl⁃2同源，均为抗凋亡基因，其编码产物为20kD蛋白质，在羧基C端与Bcl⁃2蛋白有40%的同源性。A1蛋白主要定位于线粒体外膜，通过C末端疏水性氨基酸直接影响线粒体膜功能，阻止细胞凋亡［6］。

3.3 本研究的意义 本实验发现A1蛋白的表达与前列腺癌细胞的增殖水平和PSA的浓度密切相关。随着PSA浓度的增高，A1蛋白表达增高，抑制凋亡能力上升。特别当PSA浓度在4～10μg／L时，难以鉴别诊断前列腺癌和前列腺增生时，将A1和PSA联合检测对前列腺癌进行早期诊断，可明显提高对前列腺癌诊断的准确性，提高了前列腺癌诊断的灵敏度和特异性，减少病人不必要的活检，为前列腺癌疾病诊断、治疗预后观察提供临床价值。

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The clinical value of combined detection of A1 protein and prostate specific antigen in prostate cancer and prostatic hyperplasia

MA Zeng⁃huang．Huangshi Center for Clinical Laboratory，Huangshi435000，China

ObjectiveThis study aims to investigate the clinical value of combined detection of PSA and A1 to dif⁃ferentiate prostate cancer from bengin prostatic hyperplasia.M ethodsThe serum PSA levels were detected by electro chemiluminescence，The expression of A1 in the prostate cancer and benign prostatic hyperplasia was detected by RT⁃PCR and western⁃blotting.The relationship of expression of A1 protein with PSA was analyzed.ResultsThe expression of A1 protein in patients with prostate cancer was significantly lower than that in patients with benign prostatic hyperplasia and healthy persons（P＜0.01）.The expression of A1 protein was related with the concentration of PSA.ConclusionsA1 protein is correlated with themodulation of proliferation in the development of prostate cancer.The expression of A1 protein plays an important role in the development of prostate cancer.The combined detection of PSA and A1 protein is helpful in the diagnosis of prostate cancer.

prostate cancer；prostatic hyperplasia；prestate specific antigen；A1 protein

R 697.3

A

10.3969／j.issn.1003⁃9198.2014.01.014

2013⁃05⁃27）

435000湖北省黄石市，黄石市临床检验中心