胃癌患者血清miR-300的表达及临床意义

2014-03-20龙香娥董琢杨杰吴巧萍陈慧玲

现代实用医学 2014年7期

龙香娥，董琢，杨杰，吴巧萍，陈慧玲

龙香娥，董琢，杨杰，吴巧萍，陈慧玲

目的探讨胃癌患者血清中miR-300的表达水平及miR-300作为胃癌诊断标记物的可能性。方法采用实时定量RT-PCR方法检测25例胃癌患者及15例健康志愿者血清中miR-300的表达水平；采用全自动化学发光免疫分析法，检测上述标本的血清癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）、癌抗原199（CA199）及癌抗原153（CA153）水平。结果25例胃癌患者miR-300表达水平是正常人的23.4倍，两者差异有统计学意义(=0.024)；胃癌患者血清CEA、CA125、CA199及CA153水平显著高于对照组（均＜0.05）；在胃癌的诊断中miR-300的敏感性比CEA、CA125、CA199及CA153高，但特异性较低。结论血清miR-300在胃癌中的表达水平高于正常人，对于胃癌的诊断具有一定价值。

胃肿瘤；癌；肿瘤标志物；miR-300

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，病死率高居首位。胃癌的早期诊断、早期治疗对于提高胃癌的治疗效果、降低病死率十分有效，寻求积极有效的早期诊断胃癌的方法尤为重要。目前临床上应用较多的诊断胃癌的肿瘤标志物存在着敏感度和特异度较低的缺点。本研究的主要目的是通过应用实时定量RTPCR检测胃癌患者血清与正常人群血清中miR-300的表达水平，分析miR-300在胃癌患者血清中的表达水平与正常人的差异，比较miR-300与临床常用诊断胃癌的肿瘤标志物在胃癌的诊断中的敏感性与特异性，为miR-300作为胃癌辅助诊断的分子标志物提供实验依据。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2011年11月至2012年7月宁波市医疗中心李惠利医院胃癌确诊住院患者25例，其中男17例，女8例；年龄41～84岁，平均（66.3±10.9）岁。收集15例健康志愿者作为正常对照组，其中男10例，女5例；年龄53～77岁，平均（64.4±8.0）岁。两组性别和年龄差异均无统计学意义（均＞0.05）。

1.2方法

1.2.1 主要试剂及仪器RNA提取试剂为美国Ambion产品TrizolLSreagent；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒为TAKARA公司产品；U6及miR-300特异RT及PCR引物购于上海吉玛制药技术有限公司。实时定量PCR仪为美国Stratagene的MX3005P PCR自动系列化分析仪。

1.2.2 检测方法

1.2.2.1 血清总RNA提取及含量测定收集各实验对象的外周血5 ml，离心分离得所有血清标本放于－20℃冰箱冻存待用。按照抽提RNA试剂Trizol LSreagent的说明书抽提各样本血清总RNA。抽提的RNA溶解于10lDEPC水中。使用分光光度计测定提取的RNA样品在260 nm和280 nm的吸收值用以分析RNA的纯度。OD260/OD280在1.8～2.0时RNA纯度较高。按1OD=40gRNA的公式计算提取的RNA含量。

1.2.2.2 逆转录反应及实时荧光定量PCR检测miRNA-300的水平用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。以逆转录所得的cDNA为模板，用荧光定量PCR技术检测miRNA-300的表达水平。以U6小RNA作参照，每一样品设3个复孔，均分别扩增miRNA和U6小RNA，用Mx3005P QPCR System进行反应。反应结束由计算机自动计算得到各反应管Ct值。然后根据公式计算Ct、Ct的值，计算公式为：Ct=Ct miRNA－Ct U6；Ct=Ct实验组－Ct对照组。最后以2－△△Ct表示实验组miR-300的表达水平相对于对照组的差异倍数。参照相关文献，当一个标本的2－Ct值＞2.00时，被认为阳性[1]。

1.2.2.3 其他肿瘤标志物检测血清癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）、癌抗原199（CA199）、癌抗原153（CA153）均采用化学发光法检测，仪器及试剂盒为Beckman公司产品。肿瘤标志物阳性界定值为：CEA＞5ng/ml、CA125＞35 U/ml，CA199＞37 U/ml，CA153＞38 U/ml。

1.3 统计方法数据采用SPSS19.0统计软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，样本均数比较采用独立样本检验，实验至少重复3次。＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miR-300的表达水平检测结果胃癌患者血清中miR-300的表达水平较正常对照组高，25例胃癌患者血清miR-300表达水平是正常人的23.4倍，按文献报道的2－Ct值＞2.00为阳性结果的标准，胃癌患者血清miR-300的阳性率为96%；参照文献报道的倍数＞4，认为相对表达差异显著[2]，25例患者中有21例明显高于正常组，占整体研究患者的84%。正常对照组Ct平均为（－1.63±0.68），实验组Ct平均为（－5.18±2.03）；两组差异有统计学意义（=8.03，＜0.01）。见表1和封三彩图3。

2.2 血清CEA、CA125、CA199、CA153检测结果研究结果显示25例胃癌组血清CEA、CA125、CA19-9、CA153平均水平比15例正常组高，且两者差异有统计学意义（=2.72、2.35、2.36、3.19，均＜0.05）。见表2。

表1 胃癌患者血清中miR-300的表达水平

2.3 血清miR-300及血清肿瘤标志物检测胃癌的特异性及敏感性25例胃癌患者中，miR-300检测结

果为阳性的有24例，而血清肿瘤标志物CEA、CA125、CA199、CA153的检测中阳性例数分别为8例、10例、11例、16例，可见血清miR-300在胃癌的诊断中敏感度较其他4种常用血清肿瘤标准物高。15例正常组中，miR-300检测结果为阳性的有2例，血清肿瘤标志物CEA、CA125、CA199、CA153的检测中阳性例数分别为1例、1例、0例、1例，血清miR-300在胃癌的诊断中特异性较其他血清肿瘤标志物低。见表3。

3 讨论

miRNA是一类分子大小为20～25个核苷酸的具有调控功能的非编码RNA。近年来研究人员在多种肿瘤（如肺癌、肝细胞癌及宫颈癌等）中发现了miRNA的异常表达，发现miRNA与人类肿瘤的发生、发展以及侵袭转移等密切相关，miRNA在人类肿瘤的发生和发展、侵袭转移等扮演着重要角色。已有研究发现，在胃癌的发生发展、侵袭转移及胃癌细胞的凋亡上均有相关miRNA在发挥相应的作用。在胃癌的发生发展中，miR-21、miR-27a等发挥着促癌作用[3-4]；miR-9、miR-494等发挥抑癌作用[5-6]。在胃癌的侵袭转移中，miR-19、miR-106a等发挥着促进癌癌细胞侵袭转移的作用[7-8]；miR-145等发挥抑制癌细胞侵袭转移的作用[9]。

miR-300为22个核苷酸的非编码RNA分子，已有研究结果显示miR-300调控的潜在靶基因在多种生物学进程如细胞凋亡、细胞周期调控、细胞信号转导等发挥重要作用[10-11]。本研究发现miR-300在胃癌患者血清中表达水平明显增加，25例胃癌患者中miR-300表达水平高于正常人的有24例，即阳性率达96%，21例胃癌患者的miR-300的表达水平明显高于正常人。

肿瘤标记物是由肿瘤细胞本身合成或者是由机体对肿瘤细胞反应而产生的一类物质，目前临床上诊断胃癌的常用的肿瘤标志物有CA199及CEA等。但是目前常用的肿瘤标准物都存在着阳性率和特异性较低的问题[12]。本研究发现在胃癌的诊断中miR-300有较高的敏感性，而目前临床上诊断胃癌常用的肿瘤标志物CEA、CA125、CA199及CA153等敏感性均较低；但在胃癌的诊断中miR-300的特异性较低。

本研究将为miR-300作为胃癌辅助诊断的分子标志物提供了可能性。但是本研究还存在着不足，如病例标本数量不多，非大样本量的研究，实验结果是否存在一定偏差等，需扩大病例标本数量、结合患者的临床表现进行进一步的研究。

表2 胃癌患者血清肿瘤标志物检测结果

表3 血清miR-300及肿瘤标志物检测胃癌的特异性及敏感性%

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ObjectiveTo investigate the expression level of miR-300 in serum of patients with gastric cancer and to explorethevalueofmiR-300inthediagnosisofgastriccancer.MethodsReal-timequantitativeRT-PCR(qRT-PCR) was performed to detect miR-300 level of 25 gastric cancer patients and 15 healthy volunteers.Automatic chemiluminescence immunoassay was used to detect the serum level of CEA,CA125,CA199 and CA153.ResultsThe expression of miR-300 in 25 gastric cancer patients was 23.4 times as more as the normal controls.Compared with the control group,the levels of CEA,CA125,CA199 and CA153 were higher in patients with gastric cancer.In the diagnosis of gastric cancer,the sensitivity of miR-300 was higher than that of CEA,CA125,CA199 and CA153,but the specificity of miR-300 was lower than that of CEA,CA125,CA199 and CA153.ConclusionsExpression level of serummiR-300ingastriccancerpatientswassignificantlyhigerthanthatinnormalcontrols,andithasdiagnosisvalue in gastric cancer.

Gastric neoplasm;Cancer;Tumor marker;miR-300

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.07.005

R735.2

1671-0800(2014)07-0796-04