MMP-3和TIMP-3在胃癌中的表达及其临床意义

2014-03-20马海青嵇学仙

现代实用医学 2014年7期

马海青，嵇学仙

马海青，嵇学仙

目的探讨基质金属蛋白酶-3(MMP-3)及其抑制物组织基质金属蛋白酶抑制剂-3(TIMP-3)在胃癌中的表达情况及其临床意义。方法通过免疫组化的方法检测95例胃癌组织原发灶及其淋巴结转移灶中MMP-3和TIMP-3的表达情况，并分析其与胃癌患者临床病理特征的关系。结果MMP-3在淋巴结转移灶中的阳性率(74.1%)显著高于原发灶中的阳性率(55.8%，＜0.05)，而TIMP-3在转移灶中的阳性率(37.7%)显著低于原发灶中的阳性率(66.3%，＜0.05)。MMP-3的表达与临床分期呈正相关(=0.45，＜0.05)；TIMP-3的表达与临床分期呈负相关(=－0.39，＜0.05)。结论MMP-3和TIMP-3的表达与胃癌淋巴结转移密切相关，且转移灶癌细胞MMP-3的表达明显增强，TIMP-3的表达明显下降，可作为临床判断胃癌恶性程度、淋巴结转移的重要参考指标。

胃肿瘤；癌；基质金属蛋白酶-3；基质金属蛋白酶抑制剂-3；免疫组织化学

侵袭和转移是恶性肿瘤的重要生物学特性，基质金属蛋白酶(MMPs)及基质金属蛋白酶抑制物(TIMPs)在肿瘤浸润和转移中的作用已成为近年来的研究热点，MMPs通过对细胞外基质(ECM)的降解而促进肿瘤细胞对周围组织的浸润，而TIMPs对MMPs有特异性抑制作用[1]。本文采用免疫组化EnVision法同时检测胃癌原发灶及其淋巴结转移灶组织中MMP-3和其抑制物TIMP-3的表达，旨在探讨它们在胃癌进展中的作用及其潜在的临床应用价值。现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集浙江省德清县人民医院2005年1月至2011年12月手术切除，术前均未经过化疗并经病理证实的胃癌原发灶及相应的淋巴结转移灶95份（患者95例）石蜡标本，其中男75例，女20例；年龄37～81岁，中位年龄58.9岁。按照世界卫生组织（WHO）病理组织学分类和TNM分期标准[2]：高分化腺癌14例，中分化腺癌34例，低分化腺癌47例；Ⅰ期17例，Ⅱ期35例，ⅢA期37例，ⅢB～Ⅳ期6例；伴有淋巴结转移53例，无淋巴结转移42例。标本显色不清为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分。深褐色为3分。两项相加：0～ 1分为阴性(－)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为阳性(2+)，＞5分为强阳性(3+)。1.5统计方法采用SPSS 12.0统计软件进行统计学分析，计数资料采用2检验；相关分析采用Spearman相关分析。＜0.05为差异有统计学分析。

2 结果

2.1 MMP-3和TIMP-3的表达与胃癌淋巴结转移的关系MMP-3和TIMP-3蛋白主要表达在癌细胞的细胞质内，镜下癌细胞胞质内出现棕黄色颗粒。95例胃癌原发灶、淋巴结转移灶及无淋巴转移组织中，MMP-3转移灶阳性率高于原发灶，无淋巴转移组织阳性率低于胃癌原发灶和淋巴结转移灶，3者差异有统计学意义(＜0.01)。TIMP-3转移灶阳性率低于原发灶，无淋巴结转移阳性率为100%，3者差异有统计学意义（＜0.01)。见表1。

2.2 MMP-3和TIMP-3在胃癌组织的表达及其与胃癌病理分级及TNM分期的关系MMP-3在低分化肿瘤的阳性表达率为74.5%，显著高于高分化肿瘤的33.3%（2=5.86，=0.02）；TIMP-3在低分化肿瘤的阳性表达率为55.3%，显著低于高分化肿瘤的80.0%（2=4.15，=0.04）。MMP-3的表达与临床分期呈正相关(=0.45，＜0.05)；TIMP-3的表均经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，5 m厚连续切片。抗MMP-3多克隆抗体购自美国Lab Vision公司，抗TIMP-3单克隆抗体及EnVision试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 组织标本的制备将组织标本（胃癌原发灶和转移灶组织)蜡块收齐后制备成5 m厚连续切片，行HE和免疫组化染色。

1.3 免疫组化检测一抗的稀释度MMP-3为1∶50，TIMP-3为1∶100，步骤按EnVision两步法进行。以TBS代替一抗作阴性对照，以试剂盒阳性片作阳性对照。切片脱蜡入水后，柠檬酸盐缓冲液(pH值为6.0±0.1)高压锅抗原修复2min，自然冷却至室温(约25℃)。擦干切片周围水分，3%H2O2室温孵育10 min，TBS冲洗5 min×3次，加入一抗工作液4℃过夜，TBS漂洗5 min×3次，加入过氧化物酶标记的二抗，37℃下孵育45 min，TBS漂洗5 min×3次，DAB室温下显色，镜下控制反应时间，充分冲洗中止反应。苏木精复染胞核，染色1min，1%盐酸乙醇分色3 s，脱水透明、封固。

1.4 结果判断MMP-3和TIMP-3主要表达在癌细胞的细胞质内，呈棕黄色或褐色颗粒状。根据阳性细胞百分率及显色深浅采用半定量积分法分级[3]。（1）阳性细胞百分率：未见阳性细胞者为0分，＜25%为1分，25%～75%为2分，＞75%为3分；（2）显色深浅：不显色或

达与临床分期呈负相关( =－ 0.39，P＜0.05)。见表2。

3 讨论

3.1 MMP-3的表达与胃癌的关系

MMP-3是MMPs家族成员，能降解细胞外基质中的各种蛋白成分。它主要通过直接降解细胞外基质和基膜成分，调节肿瘤细胞与基质的黏附，激活具有潜在活性的蛋白质等作用来促进癌细胞的转移。已有文献报道MMP-3在宫颈癌中表达的阳性率明显高于非癌组织，MMP-3可作为宫颈癌浸润及转移的评介指标[4]。吴晶晶等[5]检测MMP-3在胃癌组织中异常表达，与胃癌的发生、浸润、转移密切相关。本文胃癌原发灶、淋巴结转移灶及无淋巴转移组织中，MMP-3阳性率分别为55.8%、74.1%和35.7%；转移灶阳性率高于原发灶，无淋巴结转移组织阳性率低于胃癌原发灶组织及有淋巴结转移的组织，表明胃癌转移后MMP-3表达能力增加。MMP-3在胃癌晚期高表达（88.6%），而在胃癌早期低表达（47.2%）。随着晚期癌细胞的增多，MMP-3表达量随之增多，因此癌细胞产生MMP-3的能力与其侵袭转移能力密切相关。MMP-3在低分化肿瘤的阳性表达率为74.5%，显著高于高分化肿瘤的33.3%（＜0.05）；也提示对细胞外基质屏障的破坏增强，为癌的侵袭和转移提供了条件。由此可见MMP-3的表达与胃癌的分期正相关，可以作为判定胃癌转移和预后的临床指标之一。

3.2 TIMP-3的表达与胃癌的关系

TIMPs是MMPs的特异性的抑制剂，能与MMPs形成复合物抑制MMPs降解ECM的活性，阻止肿瘤的局部生长和转移，限制肿瘤新生血管的形成[6]。Mylona等[7]通过检测TIMP-3在乳腺癌组织中的表达得出，TIMP-3与肿瘤分型和临床预后有关，在预后差、恶性度高的组织中，它们表达减少。本文结果表明，TIMP-3在胃癌原发灶高表达(66.3%)，而在淋巴结转移灶低表达(37.7%)，与胃癌的转移密切相关，且转移灶癌细胞表达能力进一步下降，提示TIMP-3有抑制肿瘤细胞的转移和延长患者术后生存期的作用。

表1 MMP-3及TIMP-3的表达与胃癌淋巴结转移的关系

表2 MMP-3、TIMP-3的表达与胃癌生物学行为的关系例（%）

3.3 MMP-3和TIMP-3与胃癌的关系

TIMP-3作为MMP-3的天然抑制物可下调MMP-3的活性。当TIMP-3表达减少，则对MMP-3的抑制作用减弱，MMP-3的活性增强，对细胞外基质的降解能力增大，屏障破坏增多，有利于肿瘤细胞的侵袭和转移。本文观察到在胃癌晚期MMP-3的表达比早期增高,而TIMP-3则相反，致使MMP-3/TIMP-3的比值增高，与文献报道相一致，因此提示MMP-3/TIMP-3比例失衡与肿瘤的侵袭和转移及进程和预后有着密切的关系。这就意味着通过改变MMP-3/TIMP-3的平衡可以达到改变肿瘤的侵袭性,从而达到抗肿瘤转移的目的。总之，在胃癌组织中进行MMP-3、TIMP-3的联合检测，对判断肿瘤的预后可能有重要价值。参考文献：

[1]Jinga DC,Blidaru A,Condrea I,et al. MMP-9 and MMP-2 gelatinases and TIMP-1 and TIMP-2 inhibitors in breast cancer: correlations with Prognostic factors[J].J Cell Mol Med,2006,10(2):499-510.

[2]虞积耀,崔全才.世界卫生组织肿瘤分类及诊断标准系列:消化系统肿瘤病理学和遗传学[M].北京:人民卫生出版社, 2006:41-50.

[3]陈秋强,石麒麟,嵇学仙,等.MMP-3和TIMP-3在非小细胞肺癌及其转移灶中表达研究[J].浙江医学,2008,30(12): 1304-1306.

[4]刘鑫,拉莱,苏祖克,等.宫颈癌中CD147、MMP-3的表达及其临床意义[J].新疆医科大学学报,2009,22(5):540-541.

[5]吴晶晶,王贵吉,张明智.N-cadherin和MMP-3在胃癌中的表达及意义[J].中国现代医生,2010,48(23):31-32.

[6]Spurbeck WW,Cat Herine YE,Vanin EF, et al.Retroviral Vector pro-ducer cellmediated in vivo gene transfer of TIMP-3 restricts angiogenesis and neuroblastoma growth in mice[J].Cancer Gene Therapy, 2003,10（1）:161-167.

[7]Mylona E,Magkou C,GiannoPoulou L, et al.Expression of tissue in Hibitor of matrix metalloProteinases(TIMP)-3 Protein in invasive Breast carcinoma:relation totumorPhenotypeandclinicalout-come[J]. Breast Cancer Res,2006,8(5):57-59.