四神丸对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理形态及血清抗炎、促炎因子平衡的影响*

王 燕，朱向东，段永强，李兰珍，曹燕飞，汪 斌

(甘肃中医学院中医基础理论教研室，甘肃 兰州730000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是以腹泻、腹痛、黏液脓血便为主要临床症状，以结肠黏膜慢性炎症和溃疡形成为病理特点的一种慢性疑难肠病。该病治愈难度大，且愈后易复发［1-2］。由于UC 的发病机制尚不十分明确，现代医学缺乏特异性治疗药物。四神丸主要由肉豆蔻、补骨脂、吴茱萸、五味子组成，具有温肾健脾、止泻固肠的功效。诸多医家临床上常以四神丸加减治疗溃疡性结肠炎，疗效确切，但作用机制不清。本研究建立UC 大鼠模型，研究四神丸对实验性UC 大鼠结肠组织病理形态变化及血清中抗炎因子(IL-10)、促炎因子(IL-2、IL-6)平衡的影响，以探讨四神丸治疗UC 的作用机制，为该方的临床广泛运用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF 级Wistar 大鼠40 只，体质量(180 ±10)g，雌雄各半，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供，SPF 级实验设施合格证号为SYXKC(甘)2004 -0006 -0001561，SPF 级动物质量合格证号为SCXKC(甘)2004 -0006。

1.2 药品、试剂与仪器

四神丸，由甘肃中医学院附属医院药剂室制备。按照原方2∶4∶2∶1∶2 比例取肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸、大枣，用8 倍量700 g/L 的乙醇每次回流2 h，提取3 次，得醇提取液和醇提取药渣。合并3 次醇提取液，滤过，滤液减压回收乙醇后得醇提取浓缩液，干燥得干膏，将干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏，4 ℃冰箱保存备用。柳氮磺吡啶(SASP)，0.25 g/片，上海三维制药有限公司产品，批号H32020026。2，4，6 -三硝基苯磺酸(TNBS)，购于北京邦定泰克生物技术有限公司，由美国Sigma 公司生产，批号为2008 -16 -2;蛋白标准液、考马斯亮蓝溶液(20090825)，均购自南京建成生物工程公司;大鼠IL-2、IL-10、IL-6 检测试剂盒，购自深圳市达科为生物技术有限公司。CT14RD高速冷冻离心机，天美科技有限公司产品;Bio -Rad iMark 酶标仪，美国BLO-RAD 公司产品;303 -2 型恒温培养箱，北京科伟永鑫实验设备仪器公司产品。

1.3 模型的建立

［1 -3］方法，采用TNBS/乙醇方法建立大鼠UC 模型。将Wistar 大鼠40 只，实验前禁食24 h，自由饮水，以100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉后，一次性将TNBS/乙醇液(100 μg/g TNBS +500 g/L 的乙醇0.25 mL)用橡胶输液管轻缓注入大鼠距肛门7 ～8 cm 深的肠腔内，捏紧肛门倒置10 min 即可。空白对照组10 只大鼠采用同样方法用等量的生理盐水灌肠。

1.4 动物分组与给药

将动物分为空白对照组、模型对照组、四神丸组及SASP 组4 组，每组10 只。除空白对照组外均以100 μg/g TNBS 加500 g/L 乙醇0.25 mL 混合试剂灌肠。给药量按体表面积换算:四神丸组给予四神丸浸膏剂5 g/kg 灌胃，SASP 组按0.3 g/kg 剂量灌胃。灌胃体积均为10 μL/g，空白对照组、模型对照组灌服等体积生理盐水。各组于造模后第2 天开始灌胃，每日1 次，连续21 d。

1.5 检测指标

1.5.1 标本的采集

3 周后，脱颈处死大鼠，乙醚麻醉后于股动脉采血，室温静置10 ～20 min，3 000 r/min 离心10 min，收集上清，备检。剪取病变最明显处结肠组织5 ～8 cm，用冷PBS 缓冲液清洗结肠，部分结肠组织以40 g/L 中性多聚甲醛固定，做病理切片，HE 染色，光镜观察。

1.5.2 结肠组织病理形态及其评分

参考结肠病理组织学评分标准［4］，由两位富有经验的病理教研室老师进行双盲评分。炎细胞浸润:无0 分，轻度1 分，重度2 分。浸润深度:黏膜层1 分，黏膜和黏膜下层2 分，结肠全层3 分。溃疡深度:无0 分，上皮1 分，黏膜固有层2 分，黏膜肌层3 分。

1.5.3 IL-10、IL-6、IL-2 含量

采用双抗体夹心ELISA 法测定IL-10、IL-6、IL-2含量，严格按试剂盒要求操作。从冰箱取出大鼠血清;取出酶标板，依照次序对应分别加100 μL 的标准品于标准品孔中;分别标记样品编号，加100 μL样品于样品孔中;在对照品孔和样品孔中加50 μL的酶标记溶液;37 ℃孵育反应90 min;手工洗板6 次，每次静置25 s;将100 μL/well 加入TMB 显色，37 ℃避光温育30 min;将100 μL/well 迅速加入终止液终止反应;10 min 内放入酶标仪中用双波长即检测波长450 nm 和校正波长620 nm 同时读板，采集实验数据，制作标准曲线，计算各样本含量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计分析软件处理。计量资料数据以均数(x-)± 标准差(s)表示，组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况对比

模型对照组大鼠在造模当天开始出现觅食不主动，食量减少，稀便，肛周污浊，体质量略有下降，毛色晦暗无光泽，肛门处有粪便沾染，部分大鼠出现血便。四神丸组、SASP 组随着给药时间的持续，上述表现明显好转，部分大鼠稀便消失，粪便呈灰褐色颗粒状，毛色逐渐转为光亮润泽，食量正常，活跃，体质量略有增加。

2.2 各组大鼠结肠组织病理形态对比

模型对照组大鼠结肠组织有较大溃疡，溃疡深度大多至黏膜肌层，有明显的炎细胞浸润，且浸润深至黏膜全层，可见血管扩张充血，有糜烂，黏膜上皮层有缺失，固有层腺体明显减少及破坏，黏膜下层部分可见血管增生。两个治疗组大鼠的结肠组织病理形态有程度不同的改善，其中四神丸组溃疡基本愈合，腺体增生愈合，有明显的愈合面存在。见图1。结肠病理组织学评分结果见表1。

图1 各组大鼠结肠组织病理形态(HE，10 ×)

表1 各组大鼠结肠组织病理学变化及血清IL-2、IL-10、IL-6 含量对比 n=10，μg·L -1±s

表1 各组大鼠结肠组织病理学变化及血清IL-2、IL-10、IL-6 含量对比 n=10，μg·L -1±s

注:与空白对照组对比，* P ＜0.01;与模型对照组对比，# P ＜0.05，## P ＜0.01。

组别 剂量/(g·kg -1) 病理组织学评分IL-2 IL-10 IL-6空白对照组 0 0.75 ±0.64 28.04 ±9.77 53.97 ±11.38 177.25 ±38.65模型对照组 0 7.10 ±1.19＊＊ 43.05 ±8.42＊＊ 23.47 ±7.66＊＊ 248.05 ±46.56＊＊四神丸组 5 4.17 ±1.40## 28.57 ±2.12## 41.36 ±8.04## 183.50 ±17.74##SASP 组 0.3 3.81 ±0.78## 30.26 ±2.94## 42.36 ±12.51## 193.84 ±44.06#

2.3 各组大鼠血清IL-2、IL-10、IL-6 含量对比

与空白对照组对比，模型对照组大鼠血清IL-2、IL-6 含量增高，IL-10 水平降低，差别有统计意义(P ＜0.01)。与模型对照组对比，四神丸、SASP 组的IL-2、IL-6 含量均降低，差别有统计意义(P ＜0.01或P ＜0.05);IL-10 水平升高，差别有统计意义(P ＜0.01)。见表1。

3 讨 论

UC 发病率高，危害大。反复发作的炎症性肠病多累及直肠和远端结肠，是一种病因不明的慢性肠道炎症，以溃疡、糜烂为主要临床表现，作为炎症性肠病的一种，已被世界卫生组织列为消化系统的疑难病［4］。临床治疗目前是以皮质类固醇类和氨基水杨酸类等药物为主，然而这两类药物均存在长期服药副作用多、停药后易复发、患者耐受性差等问题，故从中医药领域探索更为理想的治疗药物已成为近期的研究重点。UC 类似于中医学的“痢疾”“休息痢”“泄泻”“便血”“肠风”等病。有研究通过规范专家经验辨证，提取证候要素，总结UC 的常见证候及其证候要素的分布特点，发现脾肾阳虚证是UC 的常见和重要证候［5］。温肾健脾法是重要的治法，临床多选治疗五更泻的名方四神丸化裁加减治疗，疗效显著，但作用机制不明。参与炎症反应的细胞因子一般分为促炎和抗炎两类，在UC 发病机制研究中，促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间的平衡失调被视为是导致UC 的重要原因。UC 的发生机制不仅涉及黏膜局部免疫紊乱，同时也与全身免疫功能失调密切相关。

IL-2 作为重要的促炎细胞因子，与B 细胞、T 细胞、单核细胞表面的IL-2 受体结合后，能引起T 细胞增殖、活化、增强NK 细胞活性、促进细胞毒T 细胞的杀伤作用，因此对于免疫调节有重要意义。有研究表明:［6］IL-2 基因敲除小鼠会发生与人类UC 相似的结肠炎症。临床研究［6］显示:UC患者IL-2 水平降低，表明IL-2 在UC 发病中起着重要的作用。IL-10 是典型的抗炎与免疫抑制性细胞因子，它的缺失能导致自发性的由Th1 T 细胞介导的类似于CD 的结肠炎［7］。研究发现:IL-10是具有多重功效的炎症抑制因子，其主要生物学活性是免疫抑制作用，能抑制IL-6、TNF-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等的产生［8］。动物实验发现:IL-10 基因缺陷小鼠在无特异性致病菌的普通动物饲养条件下能自发慢性非感染性肠道炎症［9］，说明IL-10 在维持正常肠道黏膜免疫系统调节中发挥重要的作用［10］。

IL-6 是由单核巨噬细胞产生的多向性的细胞因子，可介导免疫球蛋白的分泌，同时也可提高T 细胞的活化信号及促进细胞毒T 细胞、NK 细胞溶解细胞的能力。有研究［11-12］发现:UC 患者的血清IL-6浓度明显升高，且与病变范围和病变严重程度成正相关。本研究表明:模型对照组大鼠血清促炎细胞因子IL-2、IL-6 的含量均明显高于空白对照组，而抗炎细胞因子IL-10 的含量则明显低于空白对照组，说明抗炎和抑炎细胞因子的失衡参与了UC 的发病。经过四神丸治疗后，实验大鼠血清IL-2、IL-6含量均显著降低，而IL-10 含量显著升高。此表明:四神丸治疗UC 的机制之一可能是通过抑制促炎因子IL-2、IL-6 的表达，提高抗炎因子IL-10 的含量，进而调整了抗炎因子与抑炎因子的平衡，纠正了肠道异常免疫反应，从而使肠黏膜组织修复，炎症和溃疡消除。病理组织学检查结果与评分也与上述结论一致。

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