分光光度法测定酱豆中亚硝酸盐含量

卜彦林，张建夫，郑方圆

（1.河南省水利水电学校，河南 周口466000；2.周口师范学院 化学化工学院，河南 周口466001）

由亚硝酸盐引起食物中毒的概率较高，亚硝酸盐主要指亚硝酸钠.在蔬菜腌制过程中，由于有害微生物及硝酸还原酶的作用，硝酸盐会转化为亚硝酸盐［1，2].在某些特定的环境下，如酸性环境、微生物菌群和适当的温度下，亚硝酸盐有可能转变为亚硝酸胺.亚硝酸盐会对人体造成危害，更为严重的是能引起高铁血红蛋白症，导致组织缺氧，出现血管扩张、血压降低等症状［3，4].因此食物中亚硝酸盐的测定是食品卫生检验的必测项目之一.亚硝酸盐的测定方法有定性和定量测定，如紫外可见分光光度计、催化法分光光度计、毛细管电泳法、示波极谱法、气相色谱法和高效液相色谱法［5-7]等.用分光光度法测定试样中亚硝酸盐的含量，为食品中亚硝酸盐含量的测定提供了一种简便可行的方法.该方法灵敏、简便、准确.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

主要仪器：容量瓶，移液管，漏斗，漏斗架，比色管，比色皿，S-22PC型分光光度计（上海棱光技术有限公司），电子分析天平（北京赛多利斯公司）等.

试剂：0.05g／L饱和硼砂溶液，1.0mol／L硫酸锌溶液，150g／L亚铁氰化钾水溶液，200g／L盐酸溶液，4g／L对氨基苯磺酸溶液（避光保存），2 g／L萘乙二胺盐酸溶液，0.2g／L NaNO2标准溶液.所用试剂均为分析纯.

1.2 实验原理

在弱酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸溶液发生重氮反应，生成的重氮化合物与萘乙二胺盐酸偶联形成紫红色的偶氮染料.

1.3 实验条件的选择

1.3.1 最大吸收波长的选择

取1.00mL浓度为4μg·mL-1的亚硝酸钠标准溶液，置于50mL的容量瓶中，加入2mL的对氨基苯磺酸溶液和1mL的萘乙二胺盐酸溶液，3min后用蒸馏水定容，摇匀，静置15min.待显色稳定后，以试剂空白作参比，在不同波长下测定吸光度，绘制吸收曲线图1，可以得到亚硝酸盐的最大吸收波长是538nm.

图1 吸收曲线图

1.3.2 吸光度与络合物显色时间的关系

取1.00mL浓度为4μg·mL-1的亚硝酸钠标准溶液，置于50mL的容量瓶，加入2mL的对氨基苯磺酸溶液和1mL的萘乙二胺盐酸溶液，3 min后用蒸馏水定容，摇匀，分别取静置5，10，15，20，30，40，50，60min后的溶液，以试剂空白作参比，在538nm测得吸光度值，如表1所示，络合物的最佳显色时间为15min.

图2 吸光度与络合物显色时间的关系图

1.3.3 酸度对吸光度的影响

用1mol／L的HCl和NaOH调节溶液的pH值分别为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0.待显色稳定定容后，在538nm波长处测定其吸光度.由图3可见，当溶液pH在1.0～2.5范围内时吸光度变化不大，当pH大于3.0之后，吸光度减小，本实验中选择最适pH值2.5.

图3 酸度对吸光度的影响图

1.4 亚硝酸钠标准曲线的绘制

用移液管精确吸取4μg／mL亚硝酸钠标准液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0，2.5mL，分别置于50mL容量瓶中，各加水至25mL，分别加2mL对氨基苯磺酸溶液，摇匀.静置3～5min，各加入1mL萘乙二胺盐酸溶液，反应，并用水定容到50mL，摇匀.静置15min后，用1cm比色皿，以试剂空白为参比，用分光光度计在538nm处测定吸光度，作标准工作曲线（见图4）.得到线性方程：A＝0.0015＋1.57965C，相关系数R＝0.99678，检出限0.01447μg／mL.

图4 标准曲线图

1.5 样品的测定

1.5.1 样品的预处理

本实验中样品有两个.

样品一 海天黄豆酱

产地：广东省佛山市.配料表：黄豆，水，白砂糖，食用盐，小麦粉，酿造食醋，食品添加剂（谷氨酸钠，5＇-呈味核苷酸二钠，黄原胶，苯甲酸钠，安塞蜜，三氯蔗糖）.

样品二 家庭自制酱豆

原料：大豆，食用盐，辣椒等.

将样品用榨汁机打成匀浆，准确称取50g样品至烧杯中，加水浸泡，用150mL 70℃以上的热水分4～5次将其转移到250mL容量瓶中，加入6 mL饱和硼砂溶液并摇匀，再加入2g活性炭粉，摇匀，然后加入2mL硫酸锌溶液和2mL亚铁氰化钾溶液，振摇3～5min，再加水稀释至刻度，摇匀后用滤纸过滤，弃去最初的10mL滤液，接其后滤液50mL左右用于测定.

1.5.2 活性炭对样品中亚硝酸盐测定的影响

以样品二为例，对酱豆进行预处理，分别取40 mL，置于两个50mL比色管中，一个不加入活性炭，另一个加入2g活性炭，摇匀.待处理完后，对各样品的亚硝酸盐含量进行测定.未加入活性炭的样品测得的吸光度为0.180，加入活性炭的一份测得的值为0.211.这是由于家制酱豆加入了含有维生素C的辣椒，处理样品时加入活性炭，可以有效地消除维生素C对亚硝酸盐含量测定的影响，同时还能消除酱豆中色素对亚硝酸盐测定的影响，所以在进行实验处理样品的时候要加入活性炭.

1.5.3 样品中亚硝酸盐的测定

用移液管吸取提取液40mL，置于50mL容量瓶中，加入0.4%对氨基苯磺酸溶液2mL，摇匀，5min后再加入0.2%萘乙二胺盐酸溶液1 mL，摇匀，定容，显色15min.用S-22PC型分光光度计测定，用1cm的比色皿，以试剂空白为参比，在波长538nm处测其吸光度，从标准曲线上查出相应的亚硝酸离子的浓度.同一个样品做三个平行测定.两个样品的亚硝酸盐浓度分别为0.0105 mg／kg（样品一），0.2612mg／kg（样品二），都低于国家食品卫生标准（酱腌菜≤20mg／kg），可以放心食用.

2 实验过程分析

（1）在处理样品时加入饱和硼砂溶液，硼砂溶入水中，即被水解为等量的硼酸与硼酸二氢钠，起缓冲溶液作用.

（2）亚铁氰化钾和硫酸锌溶液作为蛋白质沉淀剂，使产生的亚铁氰化锌沉淀与蛋白质产生共沉淀.

（3）活性炭对植物中的色素和VC都具有较好的吸附作用，在进行食物中亚硝酸盐含量的测定时，加入活性炭可以有效地消除测定时产生的误差，从而提高分析结果的准确性.

3 结论

用重氮偶合法进行酱豆中亚硝酸盐的测定，最佳条件是70℃，样品中加入2g活性炭，能有效排除色素和维生素对亚硝酸盐测定造成的干扰.测定时显色剂的加入顺序为先加入2mL的对氨基苯磺酸溶液，再加入1mL萘乙二胺盐酸溶液，3min后用蒸馏水定容，摇匀，静置15min，待络合物显色稳定后，以试剂空白作参比，用1cm的比色皿在538nm处，用分光光度计测定溶液的吸光度.

实验标准曲线的线性方程为A＝0.0015＋1.57965C，相关系数R＝0.99678.

［1]李基银.蔬菜腌渍过程亚硝酸盐生成规律与危害防治［J].食品科学，1989（3）：1-6.

［2]杨惠芬，王淮洲.蔬菜中硝酸盐，亚硝酸盐含量及卫生学评价［J].卫生研究，1989，18（3）：45-47.

［3]汪勤，高祖民.姜汁与维生素C阻断腌渍蔬菜产生亚硝酸盐的研究［J].南京农业大学学报，1991，14（4）：99-103.

［4]张庆芳，迟乃玉，郑艳，等.关于蔬菜腌渍发酵亚硝酸盐问题的探讨［J].微生物学杂志，2003，23（4）：41-44.

［5]张敏.催化动力学光度法测定水中痕量亚硝酸根［J].环境化学，1996（2）：74-77.

［6]许金生，袁亚莉，何爱桃.催化光度法测定硝酸盐和亚硝酸盐［J].环境科学进展，1997（12）：70-72.

［7]杜红霞，贺稚非，李洪军.食品中亚硝酸盐检测技术研究进展［J].肉类研究，2006，1（1）：41-45.