miR21抑制剂对肺腺癌细胞A-549的抑制效果

姜学东，王 琼，刘长浩，王国柱

miR21抑制剂对肺腺癌细胞A-549的抑制效果

姜学东，王 琼，刘长浩，王国柱

目的探讨miR21抑制剂转染人肺腺癌细胞A-549对其体外侵袭及血管形成能力的影响。方法miR21抑制剂转染A-549细胞，同时设置未转染的A-549细胞作为对照组，转染24、48、72及96 h后，四甲基偶唑氮法(MTT)法检测两组细胞增殖抑制率；Transwell方法检测miR21抑制剂对A-549细胞侵袭的影响；小管形成实验检测miR21抑制剂对血管形成的影响。结果转染24 h，两组抑制率比较，差别无统计学意义；转染48 h及以后，抑制剂组抑制率均高于对照组，差别有统计学意义(P<0.05)。Transwell检测结果显示miR21抑制剂组每个视野细胞数(11.60±5.32)个远少于对照组(107.60±3.21)个，两组差别有统计学意义(P<0.01)。抑制剂组每视野小管计数平均(159.30±0.51)个，远少于对照组(508.80±1.30)个，两组差别有统计学意义(P<0.01)。结论miR21抑制剂能够明显抑制A-549的侵袭能力，并能明显抑制血管内皮细胞血管生成，提示miR21抑制剂可以作为潜在的肺癌基因治疗的新方法。

miR21抑制剂；细胞侵袭；血管形成；肺腺癌

Micro RNA (miRNA) 是一类内源性非编码小分子RNA，是人类基因组的主要调控因子。目前这些微小的细胞成分已进入到首选药物的行列中[1,2]。特别是在癌症中，某些miRNA本身就是非常有“诚意”的癌基因和肿瘤抑制基因，完全符合成为理想干预治疗点的严格标准。“癌基因依赖”一词，过去专指蛋白质编码的癌基因，本意是指癌症细胞生存特异性地依赖某个激酶，因此对其抑制剂异常敏感，最近这个术语已延伸用于miRNA[3]。miRNA的治疗功能是基于其天然的催化过程，1个既定的miRNA可以控制多种癌基因，并对癌症中的致癌通路进行管制。正是由于miRNA具有这种能力，同时鉴于癌症是一种不能通过针对单个基因而被成功治疗的异质性疾病[4]，因此未来对miRNA的控制能力可能是治疗成功与否的关键。miR21是人类细胞或组织中存在较为广泛并且发现较早的miRNA，在人类miRNA的功能研究中发挥了不可替代的作用。既往研究发现，miR21在肿瘤的发生发展中充当了抗凋亡因子的角色[5]。

本研究通过转染miR21抑制剂至肺腺癌细胞A549，观察其对A549细胞体外侵袭及血管形成的影响，为肺腺癌的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 由中国医学科学院上海细胞生物研究所提供人肺腺癌细胞A-549、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，美国GIBCO 提供RPMI1640培养液，上海吉玛提供miR21抑制剂，美国Corning提供Lipofectamine 2000(Invitrogen)、Transwell小室、96孔板，美国BD提供Matrigel胶。

1.2 细胞培养和细胞转染 无菌培养瓶中接种人肺腺癌细胞A-549和HUVEC细胞，加入含10%胎牛血清的适量PRMI-1640培养液，5%CO2的37 ℃培养箱中常规培养。用0.25%胰酶消化人肺腺癌细胞A549和HUVEC细胞，取对数期生长细胞，计数细胞后用miR21 抑制剂终浓度100 nM转染A549细胞(抑制剂组)，同时设定未转染的A549细胞作为对照组。

1.3 MTT检测 取对数期生长期A549细胞于37 ℃培养液，无CO2条件下培养。调整细胞浓度为5×104/ml，按每孔200 μl接种于96孔板，各组设4个平行孔，每孔反应体系总体积为200 μl。在转染细胞1、2、3、7、14 d时，每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml MTT，继续培养4 h。吸去培养液后加入150 μl二甲基亚砜(DSMO)，在微量振荡器振荡10 min，室温孵育30 min，检测光密度值(OD)。凋零组OD值为不加细胞的空白凋零A490的OD值均数，各浓度组的OD值为平行孔的平均OD值。对照组OD值为空白对照组的平均OD值， miR21抑制剂抑制人肺腺癌细胞A549增殖的作用采用细胞增殖抑制率CI表示，计算公式如下：CI(% ) = (对照组-实验组)OD/(对照组-凋零组)OD×100%。相同条件下实验重复3 次。

1.4 侵袭实验和小管形成试验 用RPMI-1640培养液稀释Matrigel，稀释比例为1∶4。在Transwell上室中加入0.04 ml的Matrigel稀释液，孵育1 h，使胶凝固，保持37 ℃。每组人肺腺癌细胞A-549用无血清培养液(含0.1% BSA)重新悬浮，调整细胞浓度为2.0×105/ml。上室加入0.01 ml细胞，下室加入0.5 ml含血清培养液，CO2培养2 d后，取出小室，用棉签擦掉上膜细胞，小室以甲醇固定和结晶紫染色各15 min，然后镜检，每个滤膜取5个视野(×100)，计数取平均值并分析。测取96孔板-20 ℃预冷后，每孔用500 μl的Matrigel原液包被，摇动使之均匀分布于孔的各个部位并避免产生气泡。保持温度37 ℃，孵育1 h，使胶凝固。调整HUVEC细胞浓度至2.0×105/ml，每孔接种0.1 ml，继续培养2 d后用显微镜观察，取5个视野(×100)，取均值计数，照相分析。

2 结 果

2.1 MTT法实验 转染24 h，两组抑制率比较，差别无统计学意义；转染48 h及以后，抑制剂组抑制率均高于对照组，差别有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2 侵袭实验 抑制剂组每个视野细胞计数平均(11.60±5.32)个，对照组(107.60±3.21)个；与对照组相比，抑制剂组穿过基质胶的细胞数量明显少于对照组(图1)，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.3 小管形成试验 抑制剂组每视野小管计数平均(159.30±0.51)个，对照组(508.80±1.30)个，抑制剂组与对照组比较，能明显抑制血管形成(P<0.01，图2)。

3 讨 论

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升，其中肺腺癌约占50%，对人们健康危害极大[6]。药物基因组学和分子生物学的迅速发展，使得肺癌的个体化治疗在临床实践中得到运用，基因治疗作为一种特异高效的强治疗方法，越来越受到人们重视。近年来，随着分子生物学和分子遗传学理论和技术的发展，以及人们对肺癌发病机制的了解日益深化，说明了很多基因可作为肺癌基因治疗的有效靶基因。

近年来，miRNA在多种生物体中的存在不断得到证实。研究者用生物信息学、基因表达和克隆等方法发现了大量未知miRNAs，并将这些miRNAs归类编号[7]。miR21位于17q23.2染色体FRA17B脆性区域上，是具有自主转录单位的一种miRNA[8]。研究表明，miRNA有致癌作用，在多种肿瘤细胞中miR21的表达均显著异常，参与调控多种抑癌基因的表达。研究发现，在神经胶质瘤细胞中，miR21的表达升高，抑制miR21 能促进细胞凋亡，致使凋亡相关蛋白酶活性升高，使神经胶质瘤细胞生存能力显著降低[9]。研究表明，miR21作为介入治疗的靶标，抑制miR21可上调TMP1、PDCD4和maspin的表达，减少乳腺癌MDA-MB-231细胞转移与侵入肺部[10]。抑制miR21可以作为晚期癌症防治的一种新的治疗措施。

本研究中，MTT实验显示，导入miR21抑制剂能够明显抑制肺腺癌细胞A549；侵袭实验结果显示，导入miR21抑制剂的肺腺癌细胞A549较未导入的A549细胞，增殖明显被抑制；同样，导入miR21抑制剂的穿膜细胞数明显少于未导入miR21抑制剂的A549细胞。小管形成实验结果显示，导入miR21抑制剂的HUEC细胞形成血管的细胞数明显少于未导入miR21抑制剂的HUVEC细胞。

综上所述， miR21抑制剂转染肺腺癌细胞A549后增殖可明显被抑制，同时miR21抑制剂转染的HUVEC细胞能够明显抑制内皮细胞血管形成能力，以及细胞的侵袭活性。由此表明，miR21可能通过抑制肿瘤组织内血管的生成能力及肺癌细胞的侵袭能力，从而抑制肺癌的发生发展过程，这将为肺腺癌基因治疗研究提供新的试验依据和理论基础。

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(2014-01-21收稿 2014-02-07修回)

(责任编辑 武建虎)

InhibitionofmiR21inhibitoronA-549cellsinvitro

JIANG Xuedong, WANG Qiong, LIU Changhao, and WANG Guozhu. Department of Thoracic Cardiovascular Surgery, Liaoning Provincial Corps Hospital, Chinese People’s Armed Police Forces, Shenyang 110034, China

ObjectiveTo study the inhibition of miR21 inhibitor on the invasion and anti-angiogenesis of A-549 cells.MethodsMiR21 inhibitor was transfected into A-549, and the control group was set up. 24, 48, 72, 96 hours after transfection, the effect of growth suppressing was quantified by 3-2(4，5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) assay, anti-invasion was observed by transwell assay. Tube formation assay was used to detect the effects of miR21 inhibitor on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) angiogenesis.ResultsTwenty-four hours after transfection, the suppressing rate was different between the two groups; 48, 72, 96 h after transfection, the suppressing rates in inhibition group were higher than those in control group, the difference was statistically significant(P<0.05). By transwell assay, number of cells in inhibition group (11.60±5.32) was less than that in control group (107.60±3.21), the difference was statistically significant(P<0.01). Tubes in inhibition group (159.30±0.51) was less than that in control group (508.80±1.30), the difference was statistically significant(P<0.01).ConclusionsmiR21 inhibitor can inhibit the invasion of A-549 and angiogenesis of HUVEC. miR21 inhibitor can be a potential gene-therapy for gastric carcinoma.

miRNA21 inhibitor; invasion; angiogenesis; lung adenocarcinoma

姜学东，硕士，副主任医师，E-mail: jiangxd08@sina.com

110034沈阳，武警辽宁总队医院胸外科

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