5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌细胞株BGC803生长及死亡相关蛋白激酶基因表达的影响

沈薇 胡金瑶 高伟 赵慧

沈阳医学院基础医学院，辽宁沈阳110034

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌细胞株BGC803生长及死亡相关蛋白激酶基因表达的影响

沈薇 胡金瑶 高伟 赵慧

沈阳医学院基础医学院，辽宁沈阳110034

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对人胃癌细胞BGC803增殖、凋亡及对死亡相关蛋白激酶（DAPK）mRNA表达水平的影响。方法用不同浓度的5-Aza-CdR处理BGC803细胞，设立不含5-Aza-CdR的对照组及3个实验组：5-Aza-CdR 1 μmol/L组、5-Aza-CdR 5 μmol/L组、5-Aza-CdR 10 μmol/L组。CCK-8检测细胞的增殖情况，AnnexinⅤ/PI双染及流式细胞术检测药物处理后细胞凋亡的情况，RT-PCR检测用药前后DAPK mRNA的表达水平变化。结果实验组BGC803细胞增殖速度显著低于对照组，细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。RT-PCR结果显示，BGC803细胞中DAPK基本无表达，5-Aza-CdR处理后，细胞中DAPK mRNA表达量显著高于对照组（P＜0.05）。结论5-Aza-CdR抑制BGC803细胞增殖，并促进细胞凋亡，可能与其诱导DAPK基因表达有关。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷曰死亡相关蛋白激酶曰胃癌曰细胞增殖曰细胞凋亡

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，每年因胃癌死亡的人数位居癌症死因第2位[1]。胃癌的发生发展是涉及多个基因的复杂过程，与抑癌基因的异常改变密切相关。肿瘤表观遗传学认为基因启动子区CpG岛甲基化是抑癌基因表达下调甚至失活的重要机制，但这种变化是可逆转的，去甲基化药物能够逆转抑癌基因启动子甲基化状态，恢复其正常表达[2]。死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一种凋亡正向调节分子，可被肿瘤坏死因子α、神经酰胺、细胞外基质（ECM）存活信号和pl9AFR5等多种因子激活，进而诱导凋亡[3]。有研究表明在头颈部肿瘤、胃癌、肺癌及膀胱癌等多种肿瘤细胞中，DAPK启动子区域DNA高甲基化水平与该基因表达沉默有关[4-7]。Satoh等[8]发现15%的胃癌组织存在DAPK基因启动子区CpG岛甲基化。本文以人胃癌BGC803细胞株为研究对象，研究体外去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）对胃癌细胞株增殖、凋亡及细胞中DAPK基因的表达影响，为探讨胃癌的发生发展机制及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

BGC803细胞来源于中国医科大学遗传学教研室，5-Aza-CdR购自美国Sigma公司，CCK-8购自北京碧云天公司，RPMI1640培养基购自Gibco公司，总RNA提取试剂盒，RT-PCR试剂盒，GoTaq Master Mix购自美国Promega公司，AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及药物处理RPMI1640培养液（含10%小牛血清，100 μ/mL青霉素，100 μ/mL链霉素）在37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养BGC803细胞。培养至60%汇合度时，对照组使用不含5-Aza-CdR的普通完全培养液，实验组分别为加入不同浓度5-Aza-CdR处理液分别记为5-Aza-CdR 1 μmol/L组、5-Aza-CdR 5 μmol/L组、5-Aza-CdR 10 μmol/L组，每隔24小时换液1次。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖变化将各组BGC803细胞按1500/孔接种96孔板，每组设3个复孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内孵育4 h，测定450 nm波长OD值，连测3 d，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。以上实验重复3次。

1.2.3 AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率变化细胞传代24 h后，实验组将5-Aza-CdR 10μmol/L浓度配制的培养液加入培养瓶中，对照组换普通培养掖，每24小时换液1次。待72 h后分别回收细胞，制成单细胞悬液，再用PBS离心洗涤，调整待测细胞密度为1×106个/mL。取1 mL细胞，1000 r/min,4℃离心10 min，弃上清液，加入PBS清洗细胞2次，将细胞重悬于100 μL结合缓冲液，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和10 μL PI轻轻混匀，避光室温孵育15 min后，加入400 μL结合缓冲液，立即FCM检测。

1.2.4 半定量RT-PCR检测各组细胞DAPK mRNA表达变化用总RNA提取试剂盒提取5-Aza-CdR 10 μmol/L组不同处理时间（0、24、48、72 h）的细胞内RNA，用两步法将RNA逆转成cDNA后进行PCR实验，DAPK引物序列为5'-GATAGAAATGTCCCCAAA-3'（上游）；5'-TCTTCTTTGGATCCTTGA-3'（下游），长度为343 bp。作为内参的人β-actin引物序列为5'-CCAGATCATGTTTGAGACCT-3'（上游）；5'-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3'（下游），长度为480 bp。扩增反应条件：95℃ 5 min变性，95℃复性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸10 min，4℃暂时保存。实验重复3次。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Tanon-2500 R）拍照及分析表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件，正态分布计量资料以均数±标准差（s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5-Aza-CdR对胃癌细胞株BGC803增殖的影响

与对照组比较，5-Aza-CdR 5 μmol/L组和5-Aza-CdR 10 μmol/L组的细胞在药物作用72 h后增殖力显著降低（P＜0.05）。而且随药物浓度的增加，细胞的生长抑制越明显。见图1。

图1 5-Aza-CdR对胃癌BGC803细胞增殖的影响

2.2 5-Aza-CdR对胃癌细胞株BGC803凋亡率的影响

实验组的细胞在药物处理72 h后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。对照组和实验组的细胞凋亡率分别为（5.47±1.22）%和（10.55±1.24）%，实验组细胞凋亡率较对照组显著增加（P＜0.05）。见图2。

2.3 5-Aza-CdR对胃癌BGC803细胞DAPK mRNA表达的影响

半定量RT-PCR结果表明，BGC803细胞在正常培养条件下DAPK基因表达明显受到抑制，10 μmol/L的5-Aza-CdR处理后，细胞DAPK mRNA表达水平明显升高[0 h：（0.223±0.056），24 h：（0.403±0.019），48 h：（0.705±0.018），72 h：（0.768±0.037）]，差异有统计学意义（P＜0.05），且有时间依赖性。见图3。

3 讨论

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则使基因重新活化和表达。抑癌基因启动子区域CpG岛高度甲基化可导致相关基因表达沉默，从而直接参与、影响或调控肿瘤的发生发展过程，是癌症发生的重要机制[9]。由于DNA甲基化修饰不涉及DNA序列改变，这种改变是可逆的。5-Aza-CdR是一种高效的DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂,它可与DNMT不可逆性结合，具有较强的去甲基化作用，恢复表观遗传学沉默的基因的表达水平，纠正肿瘤细胞的异常生物学特征[10-11]。目前5-Aza-CdR已在临床急性粒细胞白血病的治疗中得到较成功的应用[12]。Wang等[13]报道，胃癌SGC7901和BGC823细胞经5-Aza-CdR处理后，细胞增殖明显受到抑制。本研究用不同浓度去甲基化药物（5-Aza-CdR）处理胃癌细胞BGC803细胞72 h后，发现5-Aza-CdR能明显抑制细胞的增殖。

本研究显示，5-Aza-CdR对胃癌BGC803细胞具有诱导凋亡的作用。肿瘤细胞凋亡受众多凋亡相关基因调控。DAPK是一种钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于细胞凋亡的正调控因子，广泛参与多种途径介导的细胞凋亡[14]。在多种肿瘤中已发现DAPK基因CpG岛有不同程度的高甲基化，DAPK表达明显受到抑制[15-16]。本研究发现胃癌BGC803细胞中DAPK mRNA表达水平很弱，使用10 μmol/L 5-Aza-CdR处理细胞后，可恢复DAPK mRNA表达并呈时间依赖性升高，并且基因的表达状况与细胞的生长状况平行。由此提示，5-Aza-CdR可能通过恢复DAPK基因CpG岛的去甲基化水平，使基因恢复其转录活性，从而诱导其重新表达，发挥DAPK的肿瘤抑制作用。其具体甲基化的改变状态尚需进一步研究。

综上所述，本研究发现5-Aza-CdR抑制胃癌细胞BGC803增殖及诱导凋亡，可能与其去甲基化恢复DAPK基因表达及功能有关，这为胃癌的诊断及去甲基化治疗提供了依据。

图2 5-Aza-CdR对胃癌BGC803细胞凋亡率的影响

图3 5-Aza-CdR处理不同时间后DAPK mRNA表达情况

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Effects of 5-Aza-CdR on cell proliferation and DAPK gene expression in human gastric cancer cell line BGC803 cells

SHEN WeiHU JinyaoGAO WeiZHAO HuiCollege of Basic Medicine,Shenyang Medical College,Liaoning Province,Shenyang110034,China

Ojective To explore the effects of DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Aza-CdR)on the proliferation,apoptosis and the expression level of tumor suppressor gene DAPK in human gastric cancer cell line BGC803 cells.Methods BGC803 cells were treated with different concentrations of 5-Aza-CdR and divided into four groups,including control group,5-Aza-CdR 1 μmol/L group，5-Aza-CdR 5 μmol/L group and 5-Aza-CdR 10 μmol/L group.Cell counting Kit-8 was employed to detect cell proliferation,cell apoptosis was measured by AnnexinⅤ/PI apoptosis detection kit,RT-PCR was applied to detect the DAPK mRNA expression.Results The proliferation of BGC803 cells was significantly inhibited in a dose-dependent manner compared with control group,after 5-Aza-CdR treatment,the apoptotic rates of cells increased significantly(P＜0.05).The expression levels of DAPK mRNA was gradually increased in a time-dependent manner(P＜0.05).Conclusion 5-Aza-CdR inhibited cells proliferation,promoted cells apoptosis and induced the expression of DAPK gene in BGC803 cells.

5-Aza-2'-deoxycytidine;Death-associated protein kinase;Gastric cancer;Cell proliferation;Cell apoptosis

R734.2

A

1673-7210（2014）11（b）-0014-04

2014-08-10本文编辑：苏畅）

辽宁省教育厅杰出青年学者成长计划（编号LJQ 2012091）；辽宁省大学生创新训练计划项目（编号2013101 64002）；沈阳医学院大学生科研立项项目（编号20139002）。

沈薇（1976-），女，博士，副教授，主要从事肿瘤发展和转移的分子机制研究。