丙泊酚及其代谢物血药浓度分析方法研究进展

李莉 李培

新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐830011

丙泊酚及其代谢物血药浓度分析方法研究进展

李莉 李培

新疆医科大学药学院，新疆乌鲁木齐830011

丙泊酚是一种短效、速效静脉麻醉剂。由于丙泊酚起效极快且麻醉后舒适感较好，因此广泛用于临床。本文对丙泊酚及其代谢物血药浓度分析方法的研究现状做一综述，讲述了几种定量分析方法，主要有液相色谱法（LC）、气相色谱/质谱联用技术（GC/MS）或液相-串联质谱技术（LC-MS/MS）。分别阐述了各方法的特点及应用前景，并提出了今后丙泊酚及其代谢物分析方法的发展方向。

丙泊酚；血药浓度；分析方法；进展

丙泊酚（异丙酚，2，6-二异丙基苯酚）是一种短效静脉麻醉剂，于1970年发现，1977年首次临床试验，1989年经FDA批准进入临床应用，其作用特点是起效极快，一般推注20 s就能使人失去意识。由于丙泊酚具有起效快、诱导平稳、持续时间短、苏醒快而完全、没有咳嗽、呃逆等特点，几乎能够完全符合静脉麻醉药的“黄金标准”，被人称为“跨世纪”的新型麻醉药。因而，被广泛应用于手术期的麻醉诱导、麻醉维持、重症监护患者镇静、人工流产及脓肿切开术等短小手术。此外在进行胃镜、肠镜、支气管镜等操作时也可静注丙泊酚以减轻患者的不适感[1-2]。

丙泊酚作为麻醉剂，具有许多优点，但也有一些其不良反应的报道。丙泊酚的推注速度过快会导致意识不清、中枢神经系统抑制、低血压、气道阻塞、血氧饱和度下降[3]；长期使用丙泊酚会导致心肺功能下降[4]；丙泊酚给药剂量过高会导致高三酰甘油血症、低血压、心动过缓和呼吸骤停[3-4]；还有很高的急性中毒的风险和潜在的致命毒性[3]；其他的不良反应包括惊厥反应和强大的麻醉后遗效应[5]。

由于丙泊酚具有高亲脂性、酸性[4]和不稳定性[7]等特点，因此需要选择性强、快速、灵敏度高的分析方法。由于血液较脑脊液方便易得，因此常常研究血药浓度与其药理作用之间的相关性[8]。丙泊酚与血中的蛋白质和红细胞的结合性很强，因此全血是优先选择的生物样品[3，7，9]。国内外已有很多文献介绍了丙泊酚及其代谢物的血药浓度分析方法，下面将对丙泊酚及其代谢物的分析方法做一综述，详述各方法的特点及应用前景，为今后丙泊酚及其代谢物分析方法的发展方向提供参考。

1 丙泊酚及其代谢物的结构

丙泊酚具有较高的代谢清除率，其以葡萄糖醛酸代谢物的形式或在其苯环羟基化之后迅速从体内消除[1-2，6]。由于丙泊酚以葡萄糖醛酸代谢物的形式代谢或其苯环通过葡萄糖醛酸羟基化，因此其在血中的消除速度很快[1-2，6]。已有文献给出了丙泊酚及其代谢物的结构[2]。见图1。

2 丙泊酚的血药浓度分析方法

对于丙泊酚的血药浓度分析方法，国内外已有很多报道，主要有高效液相色谱法（HPLC）[1，4，8-23]和气相色谱/质谱联用技术（GC/MS）[3，6，24]。液相色谱-串联质谱技术（LC-MS/ MS）也已用于丙泊酚的血药浓度检测，有不经衍生化的大气压化学分离（APCI）[25]以及经衍生化[26]的电喷雾电离（ESI）这两种。

2.1 高效液相色谱法

在所有的丙泊酚血药浓度分析方法中，HPLC法应用最广。本文从检测器、内标、样品的预处理方式、色谱柱、流动相的选取这几个方面对高效液相色谱法进行了总结，见表1。

2.2 气相色谱/质谱联用技术

GC/MS在分析丙泊酚的血药浓度方面应用也较广，仅次于高效液相色谱法，尤其是近几年应用较多。本文从仪器、内标、样品的预处理、色谱柱、温度条件的选取这几个方面对气相色谱/质谱联用技术进行了总结。见表2。

2.3 液相色谱-串联质谱技术

LC-MS/MS在丙泊酚的血药浓度分析方面是比较新的分析手段，仪器中常使用的离子源有电喷雾电离源（Electrospray Ionization，ESI）和大气压化学电离源（Atmospheric pressure chemical Ionization，APCI）两种。笔者从仪器、内标、样品的预处理、色谱柱、流动相的选取这个方面进行了总结。见表3。

图1 丙泊酚及其代谢物的结构

表1 高效液相色谱法分析血样中丙泊酚浓度

表2 气相色谱/质谱联用技术分析血样中丙泊酚浓度

表3 液相色谱-串联质谱技术分析血样中丙泊酚浓度

表1～3总结了丙泊酚血药浓度的分析方法。从表中可以看出进行血样分析，要选择适宜的内标、适宜的样品预处理方法、适宜的检测仪器等。此外，评价一种分析方法合适与否，还需对其进行验证。

2.4 内标的选取

不论是HPLC和气相色谱/质谱联用技术，还是液相色谱-串联质谱技术，均需要内标，因此选择合适的内标对于校正丙泊酚的血药浓度十分重要[7，22]。文献报道测定丙泊酚血药浓度的内标有很多，如水杨酸异丁酯[4]、乙基罂粟碱[6]、2-叔丁基-6-甲基苯酚[7]、卡马西平[11]、蒽酮[12]、2，4-二叔丁基苯酚[22]、丁香酚苯酚）[26]等，麝香草酚（百里酚）是最常用的一种内标[1，8-10，13-21]。

2.5 提取方法的选取

不论是HPLC和气相色谱/质谱联用技术，还是液相色谱-串联质谱技术，在检测分析以前，均需要进行样品的预处理。丙泊酚血样的预处理主要有有机溶剂萃取法、固相萃取法、蛋白沉淀法。在进行LC-MS/MS的ESI-MS时还需进行衍生化。详述如下：

对于有机溶剂萃取法，文献报道的具有较好的提取回收率的有机溶剂有：如氯仿-乙酸乙酯[3]、环己烷[8-9，14，24]、环己烷和正丁醇的混合液[10]、环己烷和氢氧化四甲基铵（TMAH）的混合液[1，9，16]、二氯甲烷[11]。裂解细胞后，用乙腈-甲醇进行两步萃取比单纯使用甲醇、环己烷、环己烷和氢氧化四甲基铵或氢氧化四乙基铵、乙腈萃取的提取回收率高20%[22]。

对于蛋白沉淀法，常见的沉淀剂有乙腈[7，19，26]、甲醇[12，15，21，23]、高氯酸甲醇溶液[13]、高氯酸溶液[17]、饱和硫酸铵溶液[18]、三氯乙酸甲醇溶液[20]、乙腈甲醇混合液[22]。目前，在分析毒理学领域，不推荐使用诸如氯仿之类的有害溶剂。此外，由于丙泊酚的不稳定性，科研工作者尝试了很多方法来减少预处理过程中丙泊酚和内标物的损失，如在N2流下加速其挥发[1，4，7，19，22，25]进程和在蒸发浓缩前加入TMAH稀释液来降低丙泊酚和麝香草酚的损失[1，9，16]。因为如果未加入TMAH稀释液，会有75%的丙泊酚和45%的麝香草酚在挥干的过程中损失掉[1]。此外，还有研究表明，用2-氟-1-甲基-吡啶-p-甲苯磺酸盐和三乙基胺[7]和丹磺酰氯的衍生化作用[26]对丙泊酚进行衍生化，也可有效防止丙泊酚在样品制备过程中损失掉。经丹磺酰氯衍生化后，丙泊酚的信号强度明显比未衍生化的正负ESI的信号强度强[26]。

对于固相萃取法（SPE），固相萃取柱的种类有C18固相萃取柱、亲水亲油平衡（HLB）和Oasis MAX固相萃取柱[2，4，25]。固相萃取柱由甲醇和水活化[2，4，25]。当血样进入固相萃取柱后，柱子以水，接着是含有1%的KHCO3（乙腈∶水1∶9）、乙腈∶水（2∶3）[25]、甲醇和2%氨水的混合液（5∶95，V/V）[2]以及乙腈和磷酸盐缓冲液（pH 3.0）的混合液（6∶4）[4，25]清洗3次，除杂。用甲醇、乙腈或乙腈/甲醇（75∶25 V/V）进行第1次洗脱，用含有2%的甲酸的乙腈/甲醇（75∶25 V/V）[2]进行第2次洗脱，脱附。

2.6 检测方法的选取

在丙泊酚的血药浓度检测中，最常使用的是配有紫外检测器（UV）[4，8-15]和荧光检测器（Flu）[1，16-23]的液相色谱仪。GC/MS技术[3，6，24]也可用于检测丙泊酚的血药浓度。在GC/MS中，用来识别丙泊酚和麝香草酚的碎片离子峰如下：丙泊酚为m/z 163，178，117；麝香草酚蓝为m/z 135，150，91[3]。对于LC-MS/MS技术，丙泊酚和麝香草酚分别在APCI MS/MS和ESI MS/MS的177.2～161.2和149.2～133.0检测到各自的碎片离子峰。Bajpai等[27]更倾向于使用APCI而非ESI。因为APCI增强了丙泊酚的响应信号，而丙泊酚的相应信号通常是很弱的。此外，Bajpai等[27]发现丙泊酚能产生不稳定的中间原子团，这种作用降低了离子的丰富性和再现性。

2.7 血药浓度检测的方法学验证

为证明某一分析方法的适用性，需进行方法学验证。验证参数包括：选择性、特异性、线性、准确度、精密度、稳定性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）和基质效应等。因此，分析方法是否适用于丙泊酚的血药浓度检测也要进行方法学的验证。血中丙泊酚的LOD和LOQ分别是0.002～0.2和0.002～0.4 μg/mL[1，3-4，6-9，16，19，22，25-26]。方法学验证参数，如准确度、精密度、专一性、LOD、LOQ、线性、稳定性、基质效应等都已在文献中考察。日内、日间精密度和准确度均＜10%[1，4，22，25-26，28]。对于LC-MS/MS法而言，考察基质效应很重要，因为其会明显的影响血样中丙泊酚浓度在定量时的准确度和精密度。Thieme等[7]使用内标物tBuMPh来有效地解释说明血中的基质效应和其他相关基质。Beaudry[26]考察了6种不同血样的基质效应，并未发现有显著性差别。对于稳定性试验，Binert等[1]考察了含有丙泊酚的血样的保存条件，发现最适宜的储存温度为4℃，且在该条件下可分别保存60 d。含丙泊酚的血样不宜存放在-20℃条件下[1]，因为这样会导致丙泊酚的含量明显降低。另外一项研究发现，含丙泊酚的大鼠血浆可在-80℃下保存7周。此外，3次及3次以上的冻/融样品与刚制备的样品相比，丙泊酚的浓度无显著性差别[26]。

表4 血中丙泊酚代谢物的分析方法

3 血中丙泊酚代谢物的分析方法

对于血中丙泊酚代谢物的分析方法，文献报道不多。可以查到的几种分析方法同血中丙泊酚的血药浓度分析方法，只是具体条件不同。分析方法有：液相色谱-串联质谱技术[2]、高效液相色谱法[29]、气相色谱/质谱联用技术[30]，见表4。

表4总结了血中丙泊酚代谢物的分析方法。血中检测的丙泊酚的代谢物有PG、4-OH-P、2，6-二异丙基-1，4-二醌、1-QG和4-QG[2]。为了充分地分析丙泊酚的代谢物，相比于丙泊酚的分析手段，还需要不同的样品预处理方式、其他内标物或额外的衍生化。例如，以乙腈/甲醇（75∶25，V/V）进行第1次洗脱，用含有2%的甲酸的乙腈/甲醇（75∶25，V/V）进行第2次洗脱来得到丙泊酚，以麝香草酚蓝为内标。另一方面，在以SPE为基础的制备中，用含有2%的甲酸的乙腈/甲醇（75∶25，V/V）进行第2次洗脱来得到PG、1-QG和4-QG，以苯基-β-D-葡萄糖苷酸为内标[2]。在LC-MS/MS中，流动相中含有甲醇会使丙泊酚和麝香草酚蓝的离子化加强，如流动相为甲醇-水（75∶25，V/V），且含有0.025%的NH4OH[2]。

4 小结

丙泊酚的血药浓度分析方法主要是HPLC法。HPLC法的优点很多，如其应用范围广，70%以上的有机化合物均可用高效液相色谱分析，特别是对于高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，更具优势；分离效能高，可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果；分析速度快，通常分析一个样品在15～30 min，一般小于1 h，有些样品甚至在5 min内即可完成；灵敏度高，紫外检测器可达0.01 ng。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点。高效液相色谱仪价格也相对便宜，但检测器的灵敏度不及气相色谱，不能用于检测体内含量低的某些药物及代谢产物。

GC/MS法也可用于分析血中丙泊酚及其代谢物。GC/MS法具有高灵敏度、高分离效率的特点，且易用、耐用、成本低，可选择性地分析和检测大量痕量代谢物质和同分异构体等。只是该法要求分析物必须具有挥发性，而大部分代谢物是不能挥发的，这就要需要繁琐复杂的衍生化过程，而这又会导致分析结果的多变性，使色谱图复杂化，影响分析结果的重现性。

LC-MS/MS是近几年开始使用的分析方法，该技术将色谱对样品的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度以及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合，实现了色谱与质谱的优势互补，广泛应用于药物分析、环境分析、食品分析等多个领域。但是由于该法成本较高，并且不能同时测定多种物质含量，因此其在医药工业方面的应用受到限制。

由此可见，HPLC法、GC/MS法、LC-MS/MS法各有其优缺点。理想中的分析方法是快速、灵敏度高、回收率高、变异系数小、专一性强且成本低，满足所有要求的分析方法还有待于进一步探索。

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Research progress of analytical methods for the determination of Propofol and its metabolites in blood

LI LiLI PeiCollege of Pharmacy,Xinjiang Medical University,Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumchi830011,China

Propofol is a short-acting,fast-acting intravenous anesthetic.Because of Prppofol anesthesia fast and the patients feel comfortable after anesthesia,so it is widely used in clinical surgery.This review reports on the analytical methods for the determination of Propofol and its metabolites in blood,including liquid chromatography(LC),gas chromatography/mass spectrometry(GC/MS),or LC coupled with tandem mass spectrometry(LC-MS/MS).Method's features，application prospects and technical developments are also discussed.

Propofol;Concentration in blood;Analysis;Research

R969.1

A

1673-7210（2014）11（b）-0160-05

2014-08-15本文编辑：程铭）

新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（编号2014211C010）。

李培（1990.7-），女，新疆医科大学药物分析专业2012级在读硕士研究生。

李莉（1963.3-），女，博士，教授，博士生导师；研究方向：药物分析。