铜绿假单胞菌肺部感染对小鼠Toll样受体2、4的影响

纪晓莉 徐 凌 陆 奕 沈 策▲ 汤 瑾

1.苏州大学医学院，江苏苏州215123；2.上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科，上海200233；3.上海交通大学附属第六人民医院检验科，上海200233

铜绿假单胞菌肺部感染对小鼠Toll样受体2、4的影响

纪晓莉1，2徐 凌2陆 奕2沈 策2▲汤 瑾3

1.苏州大学医学院，江苏苏州215123；2.上海交通大学附属第六人民医院呼吸内科，上海200233；3.上海交通大学附属第六人民医院检验科，上海200233

目的探讨Toll样受体（TLR）2、4 mRNA在铜绿假单胞菌慢性感染小鼠肺内的动态改变及其作用。方法56只雄性Balb/c小鼠随机气道接种含有铜绿假单胞菌（PA）琼脂糖珠（感染组，34只）和无菌琼脂糖珠（对照组，22只）。于第1、3、5、7、10天处死小鼠，取肺组织细菌培养，行肺组织病理观察，ELISA法检测肺泡灌洗液（BALF）中白介素（IL）-6和IL-17的含量，采用Real-time PCR检测TLR2 mRNA及TLR4 mRNA表达。结果感染组在接种后第3天IL-6和IL-17水平均达高峰，分别为（154.83±12.51）ng/L和（601.05±25.53）ng/L，均显著高于对照组（40.05±2.98）ng/L和（213.75±9.25）ng/L，差异有统计学意义（P＜0.05），且两者在接种后第10天仍处于高水平。感染组中TLR4 mRNA的相对表达量第7天达高峰（4.09±0.25），与对照组第7天（0.97±0.05）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而TLR2 mRNA在感染组和对照组各时间相比变化均不明显（P＞0.05）。结论TLR4与小鼠肺部慢性感染PA的发生发展密切相关，其机制可能与TLR4在肺的免疫损伤中起到重要作用有关。

铜绿假单胞菌；Toll样受体；慢性肺部感染；小鼠

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种革兰阴性杆菌，是慢性肺病常见的感染病原菌，如囊性纤维化、弥漫性泛细支气管炎及支气管扩张等。由于PA分布广泛，适应能力强，也是临床常见的机会致病菌，有统计显示[1]，在ICU、呼吸内科等临床科室，PA检出率占革兰阴性菌株的23.18%，且表现出高度耐药和多重耐药。为制订新的诊疗方法治疗PA感染，需了解PA在肺部感染的发病机制。呼吸系统的免疫系统中固有免疫越来越受到重视，特别是肺泡上皮细胞可通过其表面的受体识别细菌的特异成分，其中Toll样受体（Toll like receptors TLRs）[2]主要承担了这个任务，TLR2、TLR4和TLR5可以识别革兰阴性杆菌的保守成分[3]。本研究主要观察TLR2和TLR4在小鼠肺部慢性感染PA的变化，有助于探索出新的诊疗方法解决PA感染的临床难题。

1 仪器与试药

1.1 动物与菌株

选用清洁级健康雄性Balb/c小鼠56只，6～8周龄，体重18～20 g，由上海交通大学附属第六人民医院动物房提供。铜绿假单胞菌（ATCC27853）购于中国科学院微生物研究所。

1.2 药物试剂与仪器

盐酸氯胺酮注射液（福田古田药业），低熔点琼脂糖（Bio Basic，加拿大），引物设计与合成（上海生物工程），小鼠IL-6、IL-17 ELISA试剂盒（R&D，美国），一步法PrimeScript RT-PCR试剂盒（大连宝生物工程），7500 real time PCR仪（ABI，美国），Wellscan MK3全自动酶标仪（Labsystem Dragon，芬兰）。

2 方法

2.1 包被PA琼脂糖悬液的制备

参照朱松雷等[4]的方法将冻存的标准菌株制作成包被PA的琼脂糖珠后，取微量的PA琼脂糖悬液以10的倍数稀释液接种到羊血琼脂板上，37℃5%CO2孵育24 h后观察菌落进行计数，以做参照调整琼脂糖悬液浓度至5×108CFU/mL。

2.2 动物模型制作

将56只健康小鼠随机分成两组，其中，感染组34只，经气管接种含有PA的琼脂糖悬液，对照组22只小鼠接种无菌的琼脂糖悬液。参照文献[4]的方法将50 μL PA琼脂糖悬液和无菌琼脂糖悬液分别接种感染PA组小鼠和对照组小鼠气管内，伤口予酒精消毒，不做缝合。此操作过程中感染组和对照组分别有4只和2只小鼠术后死亡。每日观察小鼠饮食情况、呼吸状况及体重变化等生理特征。接种后第1、3、5、7、10天各处死对照组小鼠4只，感染组6只。

2.3 标本收集与处理

2.3.1 标本的制备分别于各时间点取小鼠肺泡灌洗液（BALF）1.5 mL，ELISA法检测BALF中IL-6、IL-17的变化。取小鼠右上肺称重研磨培养，计数肺组织菌落；右下肺置于10%中性甲醛溶液中固定，制成石蜡切片，采用苏木精-伊红（H-E）染色。取左肺置-80℃冰箱保存，用于检测肺组织中TLR-2 mRNA和TLR-4 mRNA的含量。根据表1标准对病理切片进行评分[5]。

表1 肺组织的病理评分标准

2.3.2 实时荧光定量PCR提取肺组织RNA采用RNAsio Reagent，操作过程参照说明书，采用SYBRGreenⅡ荧光免疫法测定肺组织中TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的量。一步法实时定量PCR反应条件：42℃5 min，95℃10 s，1个循环；95℃5 s，58℃34 s，95℃15 s，60℃30 s，40个循环。TLR4的上游引物为5′-CTTCTCCCACTTCAGGCTCTT-3′，下游引物为5′-CCAGGTAGGCTCTGGTGTTCA-3′，扩增产物为166 bp；TLR2上游引物为5′-GAGCCGTTGGTGTATCTTTGA-3′，下游引物为5′-CTCCCATTCCAGGTAGGTGTT-3′，扩增产物为134 bp；GAPDH上游引物为5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游引物为5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′，扩增产物为233 bp。在ABI7500realtimePCR仪上进行PCR反应。将GAPDH作为内参比较目的基因的相对mRNA水平。

2.4 统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；不符合正态分布的计量资料数据采用秩和检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠的生理状况

感染组小鼠呛咳反应严重，活动量显著减少，精神萎靡伴体重下降。对照组小鼠术后第1天活动稍差，第2天基本恢复正常活动和饮食。

3.2 肺组织细菌负荷

感染组各时间点处死的小鼠中，肺组织匀浆细菌培养均培养出PA菌落，第10天时仍大于103cfu/g，并且单胺氧化酶试验均为阳性，对照组的小鼠均未培养出PA菌落。

3.3 肺组织的病理学变化

对照组小鼠肺组织初期肺泡有少量渗出,结构较清晰完整，第7天已经恢复正常，肺泡腔已无渗出，肺间质未见明显的炎症浸润表现。感染组小鼠的早期病理表现为肺泡内有大量渗出并伴有出血，肺间质内有大量炎症细胞浸润；第10天时表现为远端肺泡结构有塌陷，有纤维增生，仍伴有大量炎症细胞。见图1。对两组病理评分采用秩和检验，其中，感染组30例，秩和为1065，秩均值为35.5，对照组20例，秩和为210，秩均值为10.5，差异有统计学意义（Z=6.853，P＜0.05）。

图1 肺组织病理变化（HE，200×）

3.4 小鼠肺泡支气管灌洗液中细胞因子水平

感染组IL-6、IL-17水平在术后第3天达到峰值，随时间迁移有所下降，但仍然维持在较高的水平，与对照组相比较有显著增加趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组各个时间点IL-6、IL-17均表现为低水平。见表2、3。

3.5 肺组织中TLR2、TLR4 mRNA表达水平

肺组织中TLR4 mRNA表达情况：感染组各个时间点小鼠的TLR4 mRNA的表达均明显高于对照组，且差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。感染组小鼠TLR2 mRNA表达与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

4 讨论

PA慢性肺部感染是临床上常见的慢性肺部疾病，常见于囊性纤维化、弥漫性泛细支气管炎和支气管扩张等，由于肺组织长期感染，导致炎症迁延和肺部结构损伤，患者往往出现严重的呼吸道症状和肺功能障碍。随着肺组织损伤程度加重，患者可出现临床症状恶化，严重影响了患者的生活质量和生存寿命[6]，寻找新的PA感染治疗位点一直是医学界探索目标。

表2 两组小鼠肺泡支气管灌洗液中IL-6水平比较（ng/L，x±s）

表3 两组小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-17水平比较（ng/L，x±s）

表4 两组小鼠肺组织中TLR4 mRNA水平比较（x±s）

表5 两组小鼠肺组织中TLR2 mRNA水平比较（x±s）

TLRs是一类病原模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs），PRRs识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），即病原体的基本成分或病原体的产物，进而产生一系列的生物学反应。TLR4是最早发现的TLRs，通过识别脂多糖，向胞内传导信号，通过髓样分化因子88（MyD88）介导下游的信号转导，导致NF-κB等转录因子活化，激活IL-1、IL-6、IL-8、β-干扰素以及肿瘤坏死因子-α等下游炎症介质，诱导调节多种细胞因子基因的转录，最终引起相应炎症介质合成和释放[7-9]，启动针对病原微生物的固有和获得性免疫。

近年来研究显示，TLR4、TLR2与很多肺部感染性疾病发展相关[10-11]，感染后，与对照组相比较肺组织中TLR4、TLR2均高表达，其通过参与中性粒细胞的上调而参与机体炎性反应。Nathan等[12]发现，在敲除TLR2、TLR4基因的C57BL/6小鼠和野生型小鼠比较得出：在感染肺炎链球菌性角膜炎时，敲除TLR2基因的小鼠不能有效地招募中性粒细胞来协助角膜清除细菌，同时证实敲除TLR4基因小鼠无法启动固有免疫反应。目前对TLR2、TLR4在PA慢性肺部感染中的作用了解还不甚全面。本研究发现小鼠在感染PA后，与对照组小鼠相比，肺组织TLR4 mRNA显著上升，第7天时达高峰，可能机制是TLR4受体在PA感染刺激后被全面激活，第10天仍然维持高水平表达，同时肺组织HE切片也有大量的炎症细胞浸润，说明TLR4在小鼠肺部慢性感染PA时被激活。既往也有研究证实，TLR4和PA感染角膜炎密切相关，野生型小鼠感染PA时，与对照组相比较感染组角膜TLR4 mRNA水平显著上调，表明TLR4信号在感染PA时被激活，参与细菌性角膜炎反应[13]。本研究显示，TLR2 mRNA在两组中表达没有差异（P＞0.05）。推测原因可能是：①TLR2与对照组相比无变化与Ramphal等[14]的发现部分相一致，TLR2与PA肺部感染并无关联；②TLR2主要识别革兰阳性菌，与革兰阴性菌不相关[15]。

IL-6、IL-17与PA感染密切相关，PA刺激人角膜上皮细胞后，可导致IL-6等其他相关炎症因子的大量分泌[16]。有研究证实，IL-6是TLR4信号转导的下游因子，当PA刺激TLRs，较对照组PA组IL-6的上升程度显著高于对照组[17]。Ann等[18]发现，慢性感染PA的囊性纤维变性患者的痰液中IL-17 mRNA和蛋白都是高于非PA感染的囊性纤维变性患者。本研究与上述发现相符合，本研究发现小鼠感染PA后BALF中的IL-6和IL-17水平各个时间显著高于对照组（P＜0.05），第3天表达量比第10天高，可能原因是第3天时形成急性感染，为急性细菌感染的高峰，后来演变成慢性感染。感染组呈上调表达的IL-17可能提示IL-17参与PA感染后的局部免疫应答。目前有研究发现，IL-17与TLR4也有着密切联系，关节炎患者外周血单核细胞TLR4通过诱导Th17细胞分化参与关节炎疾病发生发展[17]。本研究发现TLR4和IL-17都在感染组中呈高表达，但PA慢性感染时TLR4是否参与IL-17的分泌，其机制并不十分清楚，在今后研究中可以进一步探索。

本研究通过铜绿假单胞菌致使小鼠感染，检测慢性感染PA小鼠肺组织TLR4 mRNA的表达量明显高于对照组，并且TLR4信号传导下游因子IL-6及相关炎症因子IL-17在BALF中水平也显著高于对照组，而TLR2 mRNA的表达量在感染组和对照组之间差异并无统计学意义，提示TLR2与PA慢性感染并无关联，TLR4信号在PA肺部感染时被激活，参与机体的免疫病理损伤，加重慢性肺部感染病情，如果能采取一定措施来抑制TLR4的免疫应答，将为以后了解PA肺部感染的发病机制和治疗方案的探索提供思路。

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The changes of TLR2 and TLR4 on chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection in mice

JI Xiaoli1,2XU Ling2LU Yi2SHEN Ce2▲TANG Jin3
1.School of Medicine,Soochow University,Jiangsu Province,Suzhou215123,China;2.Department of Respiratory Medicine,the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,Shanghai200233,China;3.Department of Clinical Laboratory,the Sixth People′s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University,Shanghai200233, China

ObjectiveTo investigate the function changes of toll like receptor(TLR)2,4 in mice with chronic Pseudomonas aeruginosa(PA)lung infection.Methods56 male Balb/c mice were randomly given the airway inoculated with PA agarose beads(infection group,n=34)and sterile agarose beads(control group,n=22).On day 1,3,5,7,10 after infection,mice were sacrificed.Lung tissue bacterial cultures and lung pathology were observed,interleukin(IL)-6 and IL-17 in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were observed by ELISA.The mRNA expression of TLR2 and TLR4 were detected by Real-time PCR.ResultsCompared with control group,IL-6,IL-17 levels were up to the highest levels of infection group on day 3,data of infection group were(154.83±12.51)ng/L and(601.05±25.53)ng/L,significantly higher than control group,which were(40.05±2.98)ng/L and(213.75±9.25)ng/L,the differences were statistically significant (P＜0.05);and both of them were still at high levels on day 10.On day 7 the mRNA expression of TLR4 reached a peak of(4.09±0.25)in the infection group,and the control group was(0.97±0.05),the difference was statistically significant(P＜0.05),while no significant changes of TLR2 existed in the two groups in each time(P＞0.05).ConclusionTLR4 is closely related to the occurrence and development on chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection in mice, and the mechanism is that TLR4 may be crucial for its development of immune and inflammatory injury.

Pseudomonas aeruginosa;Toll like receptor;Chronic lung infection;Mice

R563

A

1673-7210（2014）04（c）-0017-05

2013-11-22本文编辑：程铭）

纪晓莉（1986.7-），女，山东临沂人，苏州大学医学部2011级呼吸科专业在读硕士研究生；研究方向：铜绿假单胞菌的慢性感染。

▲通讯作者