非霍奇金淋巴瘤患者外周血单核细胞hepcidin可能导致慢性病贫血

韩 潇，周道斌，段明辉，汪 玄，赵永强，沈 悌，武永吉

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院血液内科，北京100730)

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodkin lymphoma，NHL)常并发贫血，总体发生率约30%［1］，贫血原因复杂，其中慢性病贫血(anemia of chronic disease，ACD)最常见，突出特点为铁利用障碍［2］。Hepcidin 是调节铁代谢的核心激素，其不恰当升高可导致铁利用障碍［2］。以往认为hepcidin 主要由肝脏分泌，但最近研究显示单核/巨噬细胞受到刺激后hepcidin 明显升高［3-4］，对铁代谢发挥调节作用，可能参与ACD的发病［5］。多发性骨髓瘤(multiple myloma，MM)患者血清和尿中hepcidin 浓度均升高，可能导致MM相关ACD 的发生［6-7］，而对于NHL 则缺乏此类报道。

本研究探讨NHL 患者外周血单核细胞表达的hepcidin 在肿瘤相关ACD 中可能发挥的作用以及其升高的机制。

1 实验方法

1.1 患者

患者签署知情同意书声明同意采取血标本用于科学研究，征得中国医学科学院北京协和医学院伦理委员会的同意。

本实验组中NHL 患者共61 人。中位年龄56岁(18 ～80 岁)，初治者36 例，复治者25 例，Ⅲ/Ⅳ期患者占68.9%(42/61 例)。NHL 组患者贫血的总体发生率为57.4%(35/61 例)，初治者38.9%(14/36 例)，复治者72%(18/25 例)。总体血红蛋白浓度(113 ±21.7)g/L，贫血患者血红蛋白浓度(97.0 ±14.6)g/L(表1，2)。

入选标准:根据WHO 2008 非霍奇金淋巴瘤诊断标准，均在北京协和医院确诊。年龄≥18 岁，包括初治和复治患者。初治患者:明确诊断后尚未接受化疗。复治患者:确诊后已经接受至少2 程化疗。贫血定义:血红蛋白男性＜120 g/L，女性＜110 g/L。除外标准:近1 周内无活动性感染的证据，肾脏受累，肾功能不全(Cr ＞132 μmol/L)，骨髓受累，胃肠道受累，胃肠道失血，溶血，脾功能亢进，淋巴瘤白血病，化疗后的骨髓抑制期(WBC＜2 ×109/L)，缺铁(血清铁蛋白＜12 ng/mL)，血清叶酸＜3 ng/mL 或维生素B12＜100 pg/mL。

表1 NHL 组与正常对照组特征比较Table 1 NHL patients baseline characteristics

表2 NHL 患者疾病相关特征Table 2 NHL patients and disease characteristics

正常对照组:共21 人，为健康志愿者。条件符合以下标准:1)年龄≥18 岁;2)无潜在感染，血清C反应蛋白正常;3)无特殊药物治疗史;4)，血白细胞、血小板、血红蛋白、血清铁、总铁结合力、血清铁蛋白、转铁蛋白饱和度、血清叶酸、维生素B12、肝肾功能正常。

以上所有患者及健康志愿者均未接受补铁、重组人促红细胞生成素、和/或输血治疗。

收集患者及健康志愿者基础实验室指标(如血白细胞数，血红蛋白，丙氨酸氨基转移酶，血清铁指标)，均为早晨空腹测得，采用临床常规检验自动化方法检测。

1.2 血标本的采集和单核细胞分离

早晨空腹状态下采取患者或健康志愿者的外周静脉血。血标本处理在采血后6 h 内进行。无抗凝剂的血标本3 000 ×g 离心5 min，血清－70 ℃保存，用于测定IL-6 和TNF-α，EDTA 抗凝血使用1∶1 0.9%氯化钠注射液稀释后采用Ficoll-Hyaque(Sigma Chemical Co．，St.Louis，MO)密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞(peripheral-blood mononuclear cells，PBMCs)。CD14 + Dynabeads 磁珠(Dynal，Oslo，Norway)从PBMCs 中分选单核细胞。磁珠与CD14 +单核细胞的混合物在磁架(MPC-6，Dynal)上分离得到，用含有0.1%胎牛血清蛋白的PBS 清洗细胞，并用磁架分离。Dynalbeads 系统分离所得的细胞纯度(＞95%)，免疫表型稳定。将结合在磁珠上的细胞直接加入TRIzol 裂解，用于进行基因表达分析。

1.3 Real-time PCR 实时定量法测定单核细胞mRNA 表达

采用Trizol Reagent(invitrogen，carlsbad，CA)按照操作说明从外周血单核细胞中提取总RNA，总RNA 按照invitrogen superscriptTMⅢfirst-strand synthesis system 进行反转录，得到cDNA。按照Takara Perfect Real time 试剂盒(Takara Biotechnology 公司)操作说明利用ABI PRISM 7900 Sequence Detector system (Applied Biosystems，Foster City，CA)进行实时定量PCR。β-actin 基因用作内对照。相对基因表达量(靶基因的表达量，相对于内对照)采用比较Ct 法的公式2－ΔΔCT计算。特异性引物序列其引物序列及扩增片段见表3。

1.4 ELISA 法测定血清IL-6，TNF-α 浓度

患者血清IL-6 和TNF-α 浓度采用酶联免疫吸附法试剂盒R＆D(Quantikine HS ELISA Kit;Minneapolis，MN)。IL-6 灵敏度为0.04 pg/mL，TNF-α 的灵敏度为0.1 pg/mL。

1.5 统计学分析

所有数据处理均采用SPSS 16．0 for windows 软件包，计量资料以均值±标准差(±s)表示，正态分布数据采用独立样本t 检验，双尾(方差齐者用t检验，方差不齐者用校正t 检验)，非正态分布者采用非参数检验(Mann-Whitney U 检验);双变量关系采用直线相关性分析，方差分析检验。

2 结果

2.1 患者与正常对照组单核细胞hepcidin 以及血清IL-6、TNF-α，单核细胞IL-6、TNF-α 的比较

NHL 组单核细胞hepcidin mRNA 表达高于正常对照组，单核细胞IL-6 mRNA 表达也升高;单核细胞TNF-α mRNA 表达与血清TNF-α 浓度均高于正常(图1)。

2.2 患者单核细胞hepcidin 与血红蛋白浓度的相关性

NHL 组单核细胞hepcidin mRNA 的表达与血红蛋白浓度似呈负相关的趋势，但无统计学相关性(图2)。

表3 引物序列及扩增片段Table 3 Primer sequences and amplified fragments

图1 NHL 患者、正常人、IDA 患者单核细胞hepcidin、IL-6、TNF-α mRNA 表达以及血清IL-6、TNF-α 浓度Fig 1 Monocytes hepcidin，IL-6，TNF-α mRNA expression and serum IL-6，TNF-α in NHL patients and normal controls(±s)

图2 NHL 患者单核细胞hepcidin 与血红蛋白浓度(Hb)的相关性Fig 2 Correlation between monocytes hepcidin mRNA and hemoglobin in NHL patients

2.3 初治患者与复治患者单核细胞hepcidin 与血红蛋白浓度的相关性

NHL 初治患者单核细胞hepcidin mRNA 的表达与血红蛋白浓度呈负相关(图3)。

2.4 初治患者贫血者与无贫血者单核细胞hepcidin 的比较

NHL 初治患者共36 例，其中贫血者14 例，无贫血者22 例。NHL 初治患者贫血者血红蛋白浓度为97.0 ±14.6 g/L，无贫血者血红蛋白浓度为130 ±13.1 g/L，初治NHL 贫血者单核细胞hepcidin mRNA 的表达高于无贫血者，同时也高于正常对照(图4)。

图3 NHL 初治患者与复治患者单核细胞hepcidin与血红蛋白浓度(Hb)的相关性Fig 3 Correlation between monocytes hepcidin mRNA and hemoglobin in untreated and treated NHL patients

2.5 初治患者单核细胞hepcidin 与铁代谢相关指标，血清IL-6、TNF-α 及单核细胞IL-6、TNF-α 的相关性

NHL 初治患者单核细胞hepcidin mRNA 的表达与与血清IL-6 浓度、单核细胞IL-6 mRNA 的表达呈正相关(图5)。

图4 初治NHL 贫血者、无贫血者及正常对照单核细胞hepcidin 的比较Fig 4 Monocytes hepcidin in untreated NHL patients with anemia and without animia and normal controls

2.6 初治患者单核细胞IL-6、TNF-α 与血清IL-6、TNF-α 的相关性

NHL 初治患者单核细胞IL-6 mRNA 的表达与血清IL-6 浓度呈正相关，单核细胞TNF-α mRNA 的表达与血清TNF-α 浓度呈正相关(图6)。

2.7 初治患者单核细胞hepcidin 与CRP 及LDH的相关性

初治NHL 患者单核细胞hepcidin mRNA 的表达与血清CRP 及LDH 均呈正相关(图7)。

3 讨论

ACD 尚无统一的诊断标准，主要依靠铁代谢指标及除外其他疾病诊断［2］。本研究NHL 患者中发生贫血者，主要为轻到中度正细胞正色素性贫血，铁蛋白升高，SI 和TIBC 下降，同时入组时已除外如骨髓受累，脾亢等其他原因导致的贫血，大致符合ACD 的诊断。

hepcidin 主要由肝脏合成和分泌［8］，但最近发现单核/巨噬细胞在炎性反应刺激下也可高表达hepcidin［4-5］。慢性感染或自身免疫病相关的ACD患者外周血单核细胞hepcidin mRNA 的表达升高，可能参与铁代谢调节［9］。NHL 患者外周血单核细胞hepcidin 是否升高，是否与Hb 水平、铁代谢相关蛋白、体内炎性因子等有关，尚不清楚。

图5 NHL 初治患者单核细胞hepcidin 与SF、TSAT%、血清及单核细胞IL-6、血清及单核细胞TNF-α 的相关性Fig 5 Correlation between monocytes hepcidin mRNA and SF，TSAT%，serum/monocytes IL-6，serum/monocytes TNF-α in untreated NHL patients

图6 NHL 初治患者单核细胞IL-6、TNF-α 与血清IL-6、TNF-α 的相关性Fig 6 Correlation between monocytes IL-6 mRNA and serum IL-6，monocytes TNF-α and serum TNF-α in untreated NHL patients

图7 NHL 初治患者单核细胞hepcidin mRNA 与血清CRP、LDH 的相关性Fig 7 Correlation between monocytes hepcidin mRNA and serum CRP/LDH in untreated NHL patients

本研究发现外周血单核细胞hepcidin 在NHL患者中明显升高，且在初治患者中与Hb 负相关，初治患者中贫血者高于无贫血者，可见NHL 初治患者Hb 水平可能受hepcidin 的影响。但复治患者外周血单核细胞hepcidin 与Hb 水平无关联，研究显示NHL 患者贫血累计发生率随化疗次数增加而升高［9］，此外一些细胞毒药物可直接抑制红系干/祖细胞，缩短红细胞寿命［10］，由此推测复治患者发生贫血的主要因素是化疗药物而非hepcidin。

hepcidin 是调节铁在不同铁池中分布的核心激素，可引起铁在网状内皮系统的储留和低铁血症［11］，本组初治患者中发生贫血者单核细胞hepcidin mRNA 的表达高于无贫血者，同时铁代谢指标提示铁相对缺乏，提示NHL 相关ACD 的发病机制可能与体内hepcidin 升高引起铁利用障碍有关。

IL-6 是诱导hepcidin 升高的主要炎性细胞因子［12-13］，TNF-α 对hepcidin 的诱导作用微弱［14］。MM 初治患者尿hepcidin 与血清IL-6 浓度正相关而与TNF-α 无关［7］，本研究中NHL 初治患者单核细胞hepcidin 与血清IL-6 浓度正相关而与TNF-α 无关，由此看来，淋巴瘤患者体内的hepcidin 可能也主要受IL-6 影响，而非TNF-α。此外，本研究还显示单核细胞IL-6 与自身hepcidin 正相关，因此推测单核细胞分泌的IL-6 可能对自身hepcidin 有上调作用。

最后，本研究还显示NHL 初治患者单核细胞hepcidin 与LDH 及CRP 明显相关，由于血清及尿hepcidin 检测未常规开展，LDH 和CRP 均为常规检测指标，可能协助判断体内hepcidin 水平。

本实验虽然显示NHL 患者体内单核细胞hepcidin 与贫血、铁蛋白、IL-6 等相关，但未能证实其在ACD 中的具体机制，未测定单核细胞hepcidin 蛋白，此外正常对照选择青年可能低估正常人群单核细胞hepcidin 水平［15］。

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