B7-H1启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测

吴胜昔，陈永文，朱广倍，费 蕾，吴玉章*

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054； 2.第三军医大学 基础部 免疫学教研室，重庆 400017)

B7-H1启动子荧光素酶报告基因载体的构建及活性检测

吴胜昔1，陈永文2，朱广倍1，费 蕾2，吴玉章2*

(1.重庆理工大学 药学与生物工程学院， 重庆 400054； 2.第三军医大学 基础部 免疫学教研室，重庆 400017)

目的构建含B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体，转染肝癌HepG2细胞进行活性检测。方法PCR扩增B7-H1启动子上游区域基因片段，并插入到含有荧光素酶报告基因的载体PGL3-Basic中构建重组子，经双酶切和测序鉴定后，将重组子转染HepG2细胞，用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶表达活性。结果成功地构建了6种不同长度的PGL3-B7-H1-Luc荧光素酶表达质粒，分别命名为P88、P175、P203、P398、P723和P960。瞬时转染HepG2后经报告基因检测，P175、 P203、 P398、 P723和P960所含5段启动子均具有转录活性，IFN-γ作用后启动子活性明显增强，而P88转染组IFN-γ作用后，荧光素酶活性无显著变化。结论成功构建了B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体。

B7-H1；启动子；双荧光素酶报告基因检测；活性测定

共刺激分子是一类细胞膜表面分子，其可为T、B细胞的活化提供辅助信号，从而调节细胞增殖、活化及分化。而缺乏共刺激信号的抗原刺激易引起T细胞的耐受、无反应性和细胞调亡[1]。近年研究表明共刺激信号通路参与了肿瘤的免疫逃逸，而通过共刺激信号途径来诱导T细胞的免疫效应功能进而治疗肿瘤是个非常有前景的研究[2]。最近，在共刺激分子与肿瘤相互关系的研究中，人们的注意力集中在了新型的B7家族共刺激分子尤其是B7-H1(B7 homolog 1)分子上。对肿瘤的研究发现，B7-H1广泛表达于各种肿瘤细胞[3]，并通过B7-H1/PD- 1(programmed death-1)途径诱导肿瘤的免疫逃逸，表明B7-H1引起的效应性细胞凋亡是肿瘤细胞免疫逃逸的一种重要机制[4]。本研究拟构建6段包含不同长度B7-H1启动子片段的荧光素酶报告基因载体, 转染HepG2细胞，加入IFN-γ作用后检测6段B7-H1启动子的活性，为后续深入探讨B7-H1在肿瘤发生、发展中的作用和机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料

DMEM培养液和胎牛血清(Hyclone公司)；胰蛋白酶(Trypsin)(Sigma公司)；琼脂糖和Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)；Ex Taq、KpnⅠ和XhoⅠ酶(TaKaRa公司)；胶回收试剂盒和DNA抽提试剂盒(Omega公司)；T4 Ligase和Dual-Luciferase ReporterAssay System kit(Promega公司)。

1.2 细胞系和质粒

人肝癌细胞HepG2细胞(本实验室保存)；PGL3 -Basic Vector、含荧光素酶基因载体(Promega公司)；PRL-TK Vector和海肾萤光素酶对照报告基因载体(Promega公司)；PGL3/B7-H1- 2405(由韩国Dr.In-Hak Choi馈赠)。

1.3 含B7-H1启动子报告基因载体的构建

1.3.1 引物的设计及合成：根据B7-H1基因的序列自行设计引物，由上海英骏公司合成, 在合成的引物序列中导入了KpnⅠ和XhoⅠ内切酶酶切位点(斜体部分)，供后续酶切鉴定用。上游引物见表1，下游引物均为5′-ccctcgagACAGAAGCGCGGCTG GT- 3′。

表1 B7-H1 5′启动子非编码区基因片段PCR上游引物Table 1 Amplification forward primers of B7-H1 5′ untranslated region gene fragments by PCR

1.3.2 启动子基因的克隆：以PGL3/B7-H1- 2405为模板，用表1所示引物进行PCR扩增，PCR反应条件为94 ℃预变性2 min, 加Ex Taq 0.2μL;94 ℃变性50 s,67.5 ℃复性1 min, 72 ℃延伸1 min, 循环30 次, 最后72 ℃再延伸10 min。用10 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，获得6条PCR扩增产物，大小分别是88、175、203、398、723和960 bp，参照Omega公司的胶回收试剂盒操作说明，回收并纯化PCR产物。

1.3.3 质粒的构建及鉴定：回收PCR产物，用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切B7-H1启动子基因的PCR产物和PGL3 -Basic载体，回收PCR产物和载体大片段，用T4 连接酶16 ℃连接12 h后，将连接产物转化DH5α感受态细菌。用Omega公司试剂盒提取菌液中质粒。经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后送上海英骏公司测序，将测序正确的重组质粒分别命名为P88、P175、P203、P398、P723和P960。

1.4 含B7-H1启动子报告基因载体的活性检测

1.4.1 细胞培养及脂质体转染：按照5×104/孔将HepG2细胞接种于24孔细胞培养板中培养，待细胞增殖至70%～80%汇合后进行转染。用无血清DMEM稀释待转染的质粒，PGL3 -Basic载体、P88、P175、P203、P398、P723和P960均按0.8 μg/孔的量，PRL-TK Vector按0.8 ng/孔的量，按50 μL/孔的体积稀释质粒，轻轻混匀，每个质粒做3个复孔。参照LipofectaminTMReagent脂质体转染系统说明，在HepG2细胞中进行P88/PRL-TK、P175/PRL-TK、P203/PRL-TK、P398/PRL-TK、P723/PRL-TK或P960/PRL-TK共转染，同时设立PGL3 -Basic/PRL-TK共转染作为阴性对照组。细胞在37 ℃培养48 h后检测荧光素酶活性。第1组无需更换培养液; 第2组培养12 h后, 弃去培养液, 加入含100 ng/mL人重组IFN-γ的培养液, 0.5 mL/孔，继续培养36 h, 测定荧光素酶活性。

1.4.2 双荧光素酶报告基因活性的检测：转染48 h后用双荧光报告系统试剂盒测定荧光素酶活性。去除培养孔中的培养液，用1×PBS(pH 7.4) 清洗细胞；每孔加100 μL被动裂解缓冲液PLB，室温振摇15 min；裂解产物转移置1.5 mL 离心管中，低温高速离心30 s，取上清；加100 μL检测缓冲液Ⅱ(LARⅡ)于待测离心管中；取20 μL 细胞裂解产物，进行目的报告基因荧火虫荧光素酶(firefly luc)及内对照海肾素荧光素酶(renilla luc)检测，计算firefly luc/renilla luc的比值，并以空载体PGL3-basic、PRL-TK Vector共转染细胞作对照。实验数据采用GraphPad prism5软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 B7-H1启动子基因片段的PCR结果

PCR扩增B7-H1 5′启动子非编码区基因片段产物经琼脂糖凝胶电泳,结果显示，其基因片段大小与预计相符, 分别是88、175、203、398、723和960 bp大小的清晰条带，表明已获得B7-H1 5′启动子非编码区基因片段(图1)。

M.DNA marker(DL2000); 1.B7-H1 960 bp; 2.B7-H1 723 bp; 3.B7-H1 398 bp; 4.B7-H1 203 bp;5.B7-H1 175 bp; 6.B7-H1 88 bp图1 PCR扩增B7-H1启动子非编码区基因片段Fig 1 Amplification of B7-H1 5′-untranslated region gene fragments by PCR

2.2 含B7-H1启动子区基因质粒酶切的鉴定

重组质粒P88、P175、P203、P398、P723和P960经限制性内切酶KpnⅠ、XhoⅠ双酶切后电泳，分别切出与对应目的基因大小相符的条带，另外还有一条约5 000 bp条带，与空载体PGL3大小相符(图2)。这表明已成功构建重组表达质粒。

M.DNA marker(DL2000); 1.P960; 2.P723; 3.P398； 4.P203; 5.P175; 6.P88图2 含B7-H1启动子区基因质粒的双酶切鉴定Fig 2 Identification of eukaryotic expression plasmids by restriction endonuclease analysis

2.3含B7-H1启动子基因片段质粒测序鉴定的结果

重组体中插入片段以及部分载体序列经测序分析, 结果显示各连接位点以及阅读框架正确, 序列与对应已知序列相符。选取P960、P723和P398测序的部分截图(图3A,B,C)，下划线序列均为上游引物，表明重组质粒P88、P175、P203、P398、P723和P960构建成功。

2.4双荧光素酶检测报告系统分析IFN-γ对B7-H1启动子活性的影响

双荧光素酶报告基因检测系统分析IFN-γ对B7-H1启动子活性的影响，结果显示，P175、P203、P398、P723和P960比P88有更高的启动子活性(Plt;0.001)；加IFN-γ作用组转染HepG2细胞48 h后，B7-H1启动子上游960 bp至175 bp区域荧光素酶的活性明显升高，然而转染重组子P88后，荧光素酶的活性显著下降，P960与P172、P203、P398和P723质粒相比，其启动子活性更为突出(Plt;0.01)(图4)。

3 讨论

B7-H1是在人体内发现的一个新的B7家族成员，与T细胞上的配体(PD- 1) 结合后可调节T细胞的活化及分化，还可通过与未知受体分子结合诱导T细胞凋亡[5- 6]。对肿瘤的研究发现，B7-H1广泛表达于各种肿瘤细胞，并通过B7-H1/PD- 1途径诱导肿瘤的免疫逃避[7- 9]。

但B7-H1分子通过何种信号通路参与肿瘤的免疫逃逸尚未明确。本研究采用PCR扩增B7-H1启动子上游区域88、175、203、398、723和960 bp基因片段，并插入到含有荧光素酶报告基因的载体PGL3-Basic中构建重组子，经双酶切和测序鉴定后分别命名为P88、P175、P203、P398、P723和P960。双荧光素酶活性分析表明，6个片段均包含核心启动子部分。而P175、P203、P398、P723和P960相比P88显示更高的启动子活性；加IFN-γ作用组转染HepG2细胞48 h后，B7-H1启动子上游960 bp至175 bp区域荧光素酶的活性明显升高，然而转染重组子P88后，荧光素酶的活性显著下降。启动子分析提示B7-H1 5′启动子非编码区有几个NF-κB结合位点[10], NF-κB在亚溶解攻膜复合物C5b- 9诱导肾小管上皮细胞上B7-H1的表达及IFN-γ诱导皮肤纤维原细胞上的B7-H1表达中起重要作用[11- 12]。通过GenomeNet分析B7-H1启动子上游175 bp内的转录因子结合位点，发现了一个NF-κB基序结合位点(位于-128 bp～-119 bp)，P88所含启动子区段无NF-κB结合位点(图5)，推测IFN-γ可能通过NF-κB通路上调肝癌HepG2细胞B7-H1的表达，但有待进一步验证。P960与P172、P203、P398和P723质粒相比，其启动子活性更为突出，通过GenomeNet分析发现，位于B7-H1启动子上游960 bp～723 bp之间可能存在deltaE、CdxA、P300和E2F等转录因子结合位点，但P723所含启动子区域无P300、E2F转录因子结合位点(图5)。推测IFN-γ还可能通过结合P300或E2F转录因子信号上调肝癌HepG2细胞B7-H1的表达，需进一步实验来证实。

图3 含B7-H1启动子5′非编码区基因质粒测序鉴定结果Fig 3 Sequences analysis of the B7-H1 gene 5′-UTR promoters

#Plt;0.001 compared with P88；*Plt;0.01 compared with P723图4 双荧光素酶报告基因分析IFN-γ对B7-H1启动子活性的影响Fig 4 Dual-luciferase reporter gene assay was per- formed to detect the effect of IFN-γ on the activity of B7-H1 promoters

The 980 bp sequence of the 5′-flanking region of B7-H1 is shown; the translation start site is indicated by +1; the arrow indicates the transcription start site; underlined sequences are possible transcription factor binding sites, as predicted by GenomeNet

图5B7-H1基因启动子区域DNA序列
Fig5NucleotidesequenceofthepromoterregionofhumanB7-H1gene

总之，本研究成功构建B7-H1启动子的荧光素酶报告基因载体，并转染人肝癌HepG2细胞后进行了荧光素酶活性分析，为后续深入探讨B7-H1在肿瘤发生、发展中的作用和机制奠定实验基础。

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Construction of luciferase reporter gene vectors containing B7-H1 promoter region and promoter activity assay

WU Sheng-xi1, CHEN Yong-wen2, ZHU Guang-bei1, FEI Lei2, WU Yu-zhang2*

(1.School of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology，Chongqing 400054；2.Dept. of Immunology, the Third Military Medical University, Chongqing 400017, China)

ObjectiveTo construct luciferase reporter gene vectors containing B7-H1 promoter region and to detect promoter activity in HepG2 cells.MethodsFragments of the B7-H1 gene 5′-UTR promoters were amplified by PCR and cloned into PGL3 basic vector and named as P88，P175, P203, P398, P723, and P960 respectively. Then HepG2 cells, were transfected with these constructed plasmids. The expression of luciferase before and after the addition of IFN-γ was detected by dual-luciferase(LUC) reporter assay system kit.ResultsFive luciferase reporter gene vectors containing B7-H1 promoter region were successfully constructed. The recombinant constructs were transiently transfected into HepG2 cells. After the addition of IFN-γ, LUC detection assay showed that the expression of LUC was significantly enhanced by P175, P203, P398, P723 or P960，but not by P88.ConclusionsLuciferase reporter gene vectors containing B7-H1 promoter region were successfully constructed，which may be valuable for further study on B7-H1 promoter activity and molecular mechanism.

B7-H1；promoter；dual-luciferase reporter assay system；activity assay

2014- 02- 28

2014- 04- 17

重庆市基础与前沿研究计划(cstc2013jcyjA10068)；重庆市教委科学技术研究项目(KJ130802)

*通信作者(correspondingauthor)：wuyuzhang@yahoo.com

1001-6325(2014)07-0955-06

研究论文

R 392

A