顺铂通过促进microRNA-214表达抑制肝癌细胞增殖

刘子文，杜永星，由 磊，舒 红，赵玉沛

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院基本外科，北京100730)

肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，近年来的流行病学资料显示其发病率和病死率在全球范围内均呈现出逐年攀升的趋势［1］。尽管对高危人群的血清肿瘤标志物及超声影像学筛查，可以使肝细胞癌患者在早期得以诊断并通过手术切除、肝移植或射频等手段根治，但最终仍易出现复发和转移，导致患者死亡［2］。肝主动脉灌注化疗(hepatic arterial infusion chemotherapy，HAIC)是用于肝癌晚期或者手术患者辅助治疗的常用策略，对改善某些选择性患者的预后效果显著［3-5］。目前，已有多种化疗药物用于HAIC，包括顺铂、5 氟尿嘧啶、吡柔比星及多柔比星等。其中，顺铂做为一种广谱抗肿瘤药物，可通过影响DNA 复制，参与细胞周期调控。但是，有关顺铂的抗肿瘤机制仍存在不明之处，对一些与肿瘤发生密切相关的分子或信号通路的影响尚不清楚。miR-214 在肝细胞癌中表达下调，发挥抑癌基因的作用，研究显示，β-catenin 是其功能靶基因，miR-214-β-catenin 调控异常可促进肝癌细胞增殖与侵袭［6-7］。本研究将探讨顺铂对miR-214 及其靶基因β-catenin 表达的影响，揭示顺铂抑制肝细胞癌进展的新机制。

1 材料与方法

1.1 材料

30 例肝细胞癌组织(北京协和医院基本外科收集，男19 例，女11 例，平均年龄55 岁，所有患者均经过医学伦理学认证并签署知情同意书)。正常肝细胞总RNA(上海美季生物工程公司)，肝癌细胞系HepG2、Hep3b 和Huh7(本实验室保存)，DMEM 培养基(Gibco 公司)，胎牛血清(Hyclone 公司)，Trizol 试剂(Invitrogen 公司)，miR-214 表达分析试剂盒(Taqman 公司产品)，miR-214 抑制剂(anti-con)及相应阴性对照品(Dharmcon 公司)，转染试剂Effectene(Qiagen 公司)，β-catenin 与GAPDH 抗体(Abcam 公司)，HRP 标记羊抗鼠lgG(Santa Cruz 公司)，增强发光剂(Pierce 公司)，CCK-8 细胞增殖分析试剂盒(同仁化学研究所)，其他所用试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取、real-time PCR 分析:RNA 提取按照Trizol 说明书进行;反转录及miR-214 real-time PCR，按照Taqman 公司操作说明进行。

1.2.2 细胞培养:HepG2、Hep3b 和Huh7 细胞用DMEM 完全培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/L 链霉素)，在5% CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱内常规传代培养。收集对数增殖期的细胞进行实验，各项实验至少重复3 次。

1.2.3 Western blot 检测:经不同浓度顺铂处理的HepG2 与Hep3b 细胞中β-catenin 的表达水平。

1.2.4 CCK-8 检测细胞增殖:检测各组细胞的增殖活性。将生长状态良好的HepG2 细胞接种于96孔板，转染时细胞达到每孔30% ～50%。分别在转染后12、24、36、48 和60 h，取出培养板，每孔加CCK-8 10 μL (5 g/L)，置37 ℃，5% CO2孵箱继续培养1 ～4 h。用酶标仪测波长为450 nm 的各吸光度值(A450值)。每组设3 个复孔，取均值绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-214 在肝细胞癌组织及细胞系中表达下调

与癌旁组织相比，miR-214 在肝细胞癌组织中表达明显下调(P＜0.01)(图1A);与正常肝细胞总RNA 相比，miR-214 在肝癌细胞系HepG2、Huh7 和Hep3b 中的表达亦下调，分别下调约52%、89%和46%(图1B)。

2.2 顺铂促进肝癌细胞内源性miR-214 的表达

顺铂在HepG2 与Huh7 细胞中的IC50分别为47.29 和24.6 mg/L(图2A)。与对照组(PBS)，经不同浓度顺铂处理的HepG2 与Hep3b 细胞，其内源性miR-214 的表达水平明显上调(图2B)。

图1 miR-214 在肝细胞癌组织及细胞系中表达下调Fig 1 miR-21 expression is downregulated in HCC tissue specimens and cell lines (±s，n=3)

图2 顺铂促进肝癌细胞内源性miR-214 的表达Fig 2 Cisplatin leads to an augment of endogenous miR-214 levels in HepG2 and Hep3b cells(±s，n=3)

2.3 顺铂抑制miR-214 靶基因β-catenin 的蛋白表达

与对照组相比，以47.29 和24.60 mg/L 顺铂处理的HepG2 与Hep3b 细胞，其内源性miR-214 分别上调2.3 和2.2 倍(图3A)。β-catenin 的表达水平则明显下调(图3B)。

2.4 抑制miR-214 可以降低顺铂对HepG2 细胞增殖的阻遏

与顺铂联合miRNA 抑制剂对照(anti-con)处理相比，Anti-214 可以抑制顺铂对内源性miR-214 表达的激活作用(图4A)，后续细胞增殖实验显示，anti-214 可以部分拮抗顺铂对HepG2 细胞增殖的抑制(图4B)。

图3 顺铂抑制miR-214 靶基因β-catenin 的表达Fig 3 β-catenin expression is downregulated in cisplatintreated HepG2 and Hep3b cells(±s，n=3)

图4 敲低miR-214 的表达可以有效拮抗顺铂对HepG2 细胞增殖的抑制作用Fig 4 Silencing of miR-214 prevents the inhibitory impact of cisplatin on cell growth in HepG2 cells(±s，n=3)

3 讨论

MiRNAs 表达失控与多种疾病密切相关，如糖尿病、心血管疾病及恶性肿瘤等［8］。与恶性肿瘤发生相关的miRNAs 根据其表达水平与功能研究，可分为癌miRNA(onco-mir)或抑癌miRNA(tumor-suppressive miRNA，ts-mir)［9］。已有报道显示，onco-mir与ts-mir 的表达与肿瘤进展及预后存在密切关系，可成为治疗的靶点和诊断或预后的生物标志物，例如miR-21、miR-122a 等在肝细胞癌中的诊断价值和靶向意义［10-12］。

近来的研究则显示，miRNA 的表达水平与化疗敏感性存在密切关系［13-14］。顺铂作为一种肝细胞癌化疗的常用药物，是否可以通过调控miRNA 所介导的基因网络发挥其抑癌效果尚不清楚。本实验选择miR-214 与顺铂的关系开展研究，miR-214 在肝细胞癌组织中表达下调，通过对其靶基因的调控发挥抑癌基因的作用。表达分析显示，顺铂可以明显上调肝癌细胞内源性miR-214 的表达水平，并抑制其靶基因β-catenin 的蛋白表达，从而发挥其治疗效果。

在拯救实验中，采用顺铂与miR-214 抑制剂联合对照，组成不同的处理组，完成miR-214 的表达干预，后续细胞增殖分析显示，抑制miR-214 可以降低顺铂对肝癌细胞增殖的阻遏作用，进一步明确了顺铂可以通过调控miR-214 的表达，影响其调节的靶基因网络，进而发挥抑制肝癌进展的作用。总之，本项研究揭示了顺铂抑制肝癌细胞增殖的潜在机制，为其在肝细胞癌化疗中的应用提供了一种新的理论依据。

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