白藜芦醇二聚体与眼镜蛇神经毒素的作用机制*

叶勇 邢海婷 郭亚

(华南理工大学化学与化工学院，广东广州510640)

白藜芦醇是存在于许多植物(如虎杖、葡萄)中的一种二苯乙烯化合物，具有抗肿瘤、抗艾滋病、抗炎镇痛及雌激素样作用等多种药理活性［1-3］.它对光敏感，紫外光可诱发其聚合［4］.笔者所在课题组的前期研究也证实，波长365nm的入射光照射导致了白藜芦醇二聚体的形成［5］.白藜芦醇二聚体在抗菌、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等方面的效果均优于白藜芦醇单体，因而成为人们关注的焦点［6-7］.眼镜蛇神经毒素(NT)是从眼镜蛇毒中分离出的一种多肽，具有中枢镇痛作用［8］;但由于NT相对分子质量较大，难以进入中枢，起效慢［9］.白藜芦醇相对分子质量小，可以进入中枢，起效快，但作用时间短［10］.如果能将白藜芦醇与NT联合给药，可以取长补短，发挥更好的镇痛作用.为了探讨白藜芦醇及其二聚体与NT的相互作用，文中通过分子模拟和光谱法分析了两者的相互作用，并对其作用机制进行了探讨，以期为实现两者的联合用药、提升临床镇痛效果提供技术和理论支撑.

1 实验

1.1 主要试剂和仪器

白藜芦醇(纯度≥99%，批号20120821)，购自广州菲博生物科技有限公司;眼镜蛇神经毒素，由笔者所在实验室从眼镜王蛇(Naja ophiophagus hannah)毒中分离获得;其他试剂均为分析纯试剂.

F-4500型荧光分光光度计(日本日立公司生产);UV-2450紫外可见光谱仪(日本岛津公司生产);5mW点状激光器(东莞三鼎光电公司生产).

1.2 分子作用模拟

采用 Discovery Studio软件进行分子对接模拟［11］，具体模拟流程如下:从 Brookhaven蛋白库(http:∥www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中下载眼镜蛇神经毒素的pdb文件，打开后进行预处理，除去水分子，整理并补充调整文件中蛋白的氨基酸残基和补充氢，施加力场;将眼镜蛇神经毒素定义为受体，定义结合位点、找到结合空穴，然后定义结合球，确定结合区域坐标;将白藜芦醇及其二聚体结构导入软件绘图窗，优化化合物的几何三维结构;接着施加力场并进行能量优化，确保配基的键长、键能、键角是正确的且处于能量稳定状态［12］.分子对接时，采用分子对接程序，将眼镜蛇神经毒素分子选为受体，白藜芦醇及其二聚体选为配体，选择结合区域坐标，运行程序.完成后在结果中可获得结合能等多项参数，进行比较.

1.3 紫外-可见光吸收曲线和荧光光谱测定

将NT用0.1 mol/L、pH=7.4的磷酸盐缓冲液配制成浓度为1.0×10-5mol/L的缓冲溶液.取5mL NT缓冲溶液6份，分别加入0、0.5×10-4、1× 10-4、2×10-4、4×10-4、8×10-4mol/L的白藜芦醇溶液1 mL，在室温下采用波长365 nm的激光照射10～50min.以缓冲液为空白扫描250～500 nm范围内的紫外-可见光吸收曲线;并以275nm为激发波长，在狭缝5nm的条件下，扫描300～500nm范围内NT与白藜芦醇的荧光光谱.

1.4 同步荧光扫描

将激发波长与发射波长间保持固定的波长间隔，来扫描和记录激发波长的变化.白藜芦醇与NT的浓度与1.3节中相同，以波长365nm的激光照射20min，分别扫描波长间隔Δ为15、60 nm的同步荧光光谱.

2 结果与讨论

2.1 白藜芦醇二聚体和NT的分子结构

表1所示为白藜芦醇及其二聚体和NT的分子结构.白藜芦醇分子结构中含有酚羟基和一个双键，分子间易发生羟基间缩合脱水或双键加成，从而形成二聚体.表1中列举的自然界存在的6种二聚体，其结合方式各不相同.NT的相对分子质量为8000，含有73个氨基酸和5个S—S键［13］.

表1 白藜芦醇及其二聚体和NT的分子结构Table 1 Molecular structures of resveratrol，dimer and NT

2.2 白藜芦醇二聚体与NT的相互作用

评价分子间相互作用通常以对接能和对接交互作用能为标准，对接能的绝对值越大，证明受体与底物的对接亲和力越强，同时也预测小分子与受体结合的活性越高;对接交互作用能越高说明受体和配体的作用越强、形成的复合物越稳定.通过软件模拟分子对接后，白藜芦醇二聚体除了(+)-白蔹素A只有4种态势外，其他均以5种态势成功与NT实现对接.其结合能见表2.

由表2可见，除了(+)-白蔹素A与NT对接能绝对值较小外，其他二聚体的对接能绝对值均大于单体对接能的绝对值，表明二聚体更易与NT结合，对NT的作用明显增强.白藜芦醇及其二聚体与NT结合的模拟图如图1所示.由图1可见，相比于白藜芦醇单体，其二聚体与NT连接的基团数明显增多.

表2 白藜芦醇及其二聚体与NT分子的结合能Table 2 Binding energy of resveratrol and dimer with NT

2.3 不同光照时间白藜芦醇与NT作用的紫外-可见光光谱和荧光光谱

图1 白藜芦醇及其二聚体与NT的结合模拟图Fig.1 Binding simulaton of resveratrol and dimer with NT

经过不同时间光照的白藜芦醇-NT体系的紫外可见光谱如图2(a)所示.由图2(a)可见:未经光照时白藜芦醇-NT体系的紫外-可见光谱在214和 305nm处有两个峰，经波长365 nm的光照射后体系的紫外-可见光谱峰形发生了变化;随着光照时间延长，第一个峰逐渐红移至238nm，第二个峰逐渐红移至310nm，吸光度也逐渐增加.对比文献［14］发现，310 nm对应于白藜芦醇二聚体的特征峰，而238nm对应于白藜芦醇二聚体与NT的交互作用峰，这表明365nm光照促进了白藜芦醇二聚体的形成及其与NT的交互作用.

以波长365nm的光照射含一定浓度白藜芦醇的NT溶液，体系的荧光光谱如图2(b)所示.由图2(b)可见，经照射后，白藜芦醇-NT体系的荧光发生了猝灭，且随光照时间延长，猝灭加剧，但最大发射波长没有明显的改变.这说明波长365nm的光促进了白藜芦醇二聚体与NT的相互作用，分子聚合加速了能量转移，但聚合物基本结构没有变化.

2.4 不同浓度白藜芦醇与NT作用后的紫外-可见光谱和荧光光谱

图2 波长365nm的光照射后白藜芦醇-NT体系的紫外-可见光谱和荧光光谱Fig.2 UV-Vis spectra and fluorescence spectra of resveratrol-NT system illuminated by laser at 365nm

以波长365 nm的光照射20 min，考察白藜芦醇浓度对白藜芦醇-NT体系的影响，结果如图3所示.由紫外-可见光谱可见:没有白藜芦醇存在时NT的紫外-可见光谱在211和275nm处有两个峰，加入白藜芦醇后，体系的紫外-可见光谱峰形发生了变化;随着白藜芦醇浓度增大，第2个峰一直保持在310nm，而第1个峰由227nm逐渐红移至233nm，吸收强度也逐渐增加.这表明第2个峰是白藜芦醇二聚体的特征峰，而第1个峰为NT与白藜芦醇二聚体结合物的吸收峰.当增大白藜芦醇浓度时，白藜芦醇二聚体增多，与NT的作用增强.

NT的最大激发光波长为275nm，以此波长的光激发，具有最大发射波长356nm.由图3(b)可见，随着白藜芦醇浓度的增加，NT在356 nm处的荧光强度逐渐降低，表明白藜芦醇对NT具有荧光猝灭聚合作用.荧光光谱中440 nm处出现一峰，且白藜芦醇浓度为1×10-4mol/L时荧光强度最大，表明该峰是NT与白藜芦醇二聚体结合物的荧光发射峰，此浓度为两者的最佳聚合浓度.

图3 白藜芦醇浓度不同时白藜芦醇-NT体系的紫外-可见光谱和荧光光谱Fig.3 UV-Vis spectra and fluorescence spectra of resveratrol-NT system at different concentrations of resveratrol

2.5 结合参数

采用经典的Stern-Volmer方程［15］进行拟合:

式中:F0和F分别为猝灭剂不存在或存在时的荧光强度;cq为猝灭剂的浓度，mol/L;Kq为猝灭速率常数;0为生物大分子内源性荧光寿命，对于生物大分子其值为10-8s［16］.F0/F与cq呈线性关系.应用式(1)计算的Kq为5.62×1012L/(mol·s)，其值大大超过生物大分子的最大动态猝灭常数2×1010L/(mol·s)［17］，可以认定其为静态猝灭.修正后的方程适合于静态猝灭，故采用如下修正的Stern-Volmer方程［14］来处理数据:

式中，n为荧光猝灭剂结合位点数，Ka为结合常数. lg(F0-F)/F与lgCq呈线性关系.通过计算，获得其结合常数Ka为5.12×105L/mol，结合位点数为1.

根据Förster能量转移理论［18］，能量转移效率E与供体受体间距离R以及临界能量转移距离R0之间的关系为

式中，R0为E=50%时供-受体间的距离，K2为偶极空间取向因子，N为介质的折射指数，φ为供体(NT)的量子效率，J为供体(NT)荧光发射光谱与受体(白藜芦醇)吸收光谱的重叠积分.

能量转移效率E由下式求出:

K2取各项随机分布的平均值，即K2=2/3;N取水和有机物的平均值1.336;φ取色氨酸残基的荧光量子效率0.118［19］;J可按下式计算:

式中，F()为供体在波长 处的荧光强度，ε()为受体在波长 处的摩尔消光系数.

研究中分别测定了NT和白藜芦醇在浓度为1× 10-4mol/L时的荧光发射光谱和紫外-可见光光谱，然后根据式(5)计算两曲线重叠部分的积分，得J= 5.79×10-15cm3·L/mol.将各值代入式(4)可得R0= 2.24nm，通过式(3)可算得R=3.40nm.蛋白的荧光主要来自色氨酸残基［20］，所求得的R值为结合部位与该残基之间的距离.结果表明，白藜芦醇与该色氨酸距离较近，容易发生非辐射能量转移.

2.6 同步荧光光谱

同步荧光光谱中不同的固定波长间隔反映了不同荧光基团的特征，因此可借助同步荧光光谱判断药物分子对荧光蛋白质构象的影响.Δ =15 nm时的同步荧光光谱显示了酪氨酸残基的光谱特征，而Δ =60nm的同步荧光光谱显示了色氨酸残基的光谱特征［21］.因氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境的极性有关，所以通过最大发射波长的改变，可判断蛋白质构象的变化.

固定NT浓度为1.0×10-5mol/L，逐渐增大白藜芦醇浓度，记录扫描波长间隔为15:60nm的同步荧光光谱，结果如图4所示.

由图4可见，随着白藜芦醇浓度的增大，350 nm以下荧光强度逐渐降低;当白藜芦醇浓度不大于1.0×10-4mol/L时，随浓度增大，最大激发波长出现红移(图4(a)中由300nm红移至383nm，图4(b)中由300 nm红移至370 nm);再继续增大白藜芦醇的浓度，最大激发波长维持不变.

上述结果显示:NT与白藜芦醇二聚体结合后构象变化明显，其中酪氨酸和色氨酸残基的亲水性有所增加，这是白藜芦醇二聚体中羟基氢键作用的结果;白藜芦醇浓度为1.0×10-4mol/L时，NT与白藜芦醇二聚体已形成较为稳定的结合物.Δ =60nm的同步荧光强度变化较Δ =15 nm的更为明显，说明白藜芦醇二聚体对色氨酸残基的作用较酪氨酸残基更强，是主要的作用位点.

3 结论

文中采用分子对接方法考察了白藜芦醇二聚体与NT的相互作用，并对不同白藜芦醇浓度和不同光照时间下白藜芦醇-NT体系的紫外-可见光谱和荧光光谱进行分析，得出以下主要结论:

(1)白藜芦醇二聚体与NT的结合能大于白藜芦醇单体与NT的结合能，白藜芦醇二聚体与NT的相互作用更强;

(2)延长光照时间和提高白藜芦醇浓度，均可使白藜芦醇二聚体与NT的相互作用增强，但最大荧光峰波长没有明显变化，表明聚合物分子基本结构没有受到影响;

(3)白藜芦醇二聚体与NT的结合常数较大，有1个结合位点，与结合点的距离较小，易发生非辐射能量转移，导致荧光静态猝灭;

(4)白藜芦醇二聚体与NT通过羟基氢键作用，导致酪氨酸和色氨酸残基亲水性增强和分子构象改变，色氨酸残基是其作用的主要位点.

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