血小板添加液体外保存血小板质量的研究

刘立坤，李永乾

(河北医科大学第三医院输血科，河北 石家庄 050051)

血小板的标准保存方法是20～24℃恒温振荡保存，此条件下血小板制品易受污染，保存期仅为5d[1]，难以满足临床大量需求。应用添加液低温保存血小板已引起广泛关注，研制适用于低温冷藏血小板的保存液非常有意义。我们采用含海藻糖的添加液替代65%血浆10℃冷藏单采血小板保存7d，并对血小板有关指标进行了检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器：血小板添加液成分，海藻糖75.00g/L、Na2HPO43.05g/L、KCl 0.37g/L、NaH2PO4·2H2O 1.05g/L、NaCl 4.05g/L、MgCl2·6H2O 0.30 g/L、Na3枸橼酸·2H2O 3.18g/L[2]；血细胞计数仪(日本Sysmex公司)；血小板聚集分析仪(美国Chronolog公司)；血气分析仪(法国Nova公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；CL-8000型全自动生化分析仪(日本岛津)。

1.2 血小板的制备及保存：取20份单采血小板，将其分为2组，实验组离心(1 000g，10min)，保留35%血浆，加入65%的血小板添加液混匀，10℃冷藏静置保存，对照组用100%血浆维持在(22±2)℃常温保存，于1、5、7d分别取样测定2组pH、血小板计数(plateled count,PLT)、低渗休克反应(hxpotonic shock response,HSR)、血小板形变能力(extent of shape change,ESC)、血小板P选择素(cluster of differentiation 62 platelet,CD62p)、葡萄糖(glucose,GLU)平均消耗量和乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)平均释放量等指标。

1.3 血小板制品质量评价指标的检测：用血细胞计数仪测定PLT；用血气分析仪测定pH；采用血小板聚集分析仪法测定ESC和HSR[3]；以IgG1PE为阴性对照，CD62pPE标记后，用流式细胞仪检测CD62p表达率[4]；采用酶显色法测定LDH，采用葡萄糖氧化酶法测定GLU。

2 结 果

2.1 2组体外保存血小板质量的比较：随着时间延长，2组pH值均呈逐渐下降趋势，但实验组pH较高，2组组间、不同时点间以及组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.01)；2组PLT指标比较平稳，在组间、不同时点间以及组间·时点间交互作用差异均无统计学意义(P>0.05)；HSR、ESC随着时间延长逐渐下降，CD62p随着时间延长逐渐升高，但2组间HSR、ESC和CD62p只在不同时点间差异有统计学意义(P<0.01)，组间和组间· 时点间交互作用差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

组别pH1d5d7dPLT(×1011/L)1d5d7dHSR(%)1d5d7d实验组7.30±0.037.22±0.057.10±0.0712.6±1.512.1±1.312.5±1.373.5±8.065.2±8.361.7±5.2对照组7.26±0.047.04±0.076.80±0.0912.4±1.412.1±1.412.4±1.273.0±8.066.3±8.363.0±5.6组间F=196.811 P=0.000F=0.027 P=0.871F=0.306 P=0.584时点间F=345.368 P=0.000F=1.545 P=0.220F=56.718 P=0.000组间·时点间F=53.769 P=0.000F=0.016 P=0.984F=0.486 P=0.617组别ESC(%)1d5d7dCD62p(%)1d5d7d实验组16.5±3.87.6±1.35.4±0.628.9±10.139.9±10.944.3±11.0对照组16.8±4.07.4±1.15.3±0.829.1±10.240.6±11.245.6±11.6组间F=0.008 P=0.931F=0.084 P=0.774时点间F=330.135 P=0.000F=109.546 P=0.000组间·时点间F=0.150 P=0.861F=0.021 P=0.979

PLT：platelet；HSR：hxpotonic shock response；ESC：extent of shape change；CD26p：cluster of differentiation 62 platelet

2.2 2组GLU消耗量和LDH释放量比较：1～7d试验组GLU平均消耗量及LDH平均释放量均明显低于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 2组保存期间GLU消耗量和LDH释放量比较

组别GLU平均消耗量LDH平均释放量实验组0.08±0.030.15±0.03对照组0.12±0.020.25±0.04t4.9618.944P0.0000.000

GLU：glucose；LDH：lactic dehydrogenase

3 讨 论

血小板对温度变化极为敏感，4℃保存的血小板输注体内后会很快被清除，止血功能远低于20～24℃保存的血小板[5]。当温度低于20℃血小板就会从正常的铁饼状变成圆球状，并发生聚集而被激活。目前标准的血小板保存条件是在20～24℃振荡保存，存放有效期仅为5d。如何增加血小板存活率及延长其保存期，减少血小板活化，已成为目前研究的热点。应用添加液保存血小板不仅可以减少输血反应的发生率，还可以节约大量的血浆资源，血小板添加液能很好地维持血小板的功能。海藻糖分子比较小，能够填充到生物蛋白质大分子的空隙中，使生物蛋白质大分子的内部结构变化受到限制，能抑制寒冷导致的血小板变形聚集[6]；海藻糖性质稳定、不易降解，在体内的分解产物是两分子的葡萄糖，对机体无毒副作用，是一种非常有研究潜力的低温血小板保护剂[7]。本研究是在血小板保存添加液Ⅲ的基础上添加海藻糖配制成血小板添加液，并以血小板添加液替代65%自体血浆保存单采血小板。

血小板的止血功能主要取决于血小板形态、活化水平、代谢情况等，反映血小板膜是否完整的重要指标主要有血小板HSR[8]；血小板形态常用ESC来评价[9]；pH与血小板的损伤相关密切；CD62p是存在于血小板α颗粒膜上的蛋白质分子，血小板激活后CD62p能与血小板质膜融合表达于血小板膜的表面，是血小板活化的较重要标志[9]，CD62p的变化与血小板活化程度具有相关性[4]。在本研究中，2组pH值在组间、不同时点间以及组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.01)，表明血小板在保存期间实验组的保存环境优于对照组；随着保存时间的延长，2组HSR、ESC逐渐下降，CD62p表达率明显升高，2组间HSR、ESC、CD62p只在不同时点间差异有统计学意义(P<0.01)，组间和组间· 时点间交互作用差异均无统计学意义(P>0.05)，表明添加海藻糖的血小板添加液在较低温度(10℃)时对血小板起到了很好的保护作用；2组PLT指标比较平稳，在组间、不同时点间以及组间·时点间交互作用差异均无统计学意义(P>0.05)，进一步证明了以上观点。10℃条件细胞代谢功能较20℃降低，血小板的GLU消耗量明显低于常温，LDH主要存在于细胞内部，当细胞受到损伤破坏后才会释放出来，本研究显示LDH在实验组的释放量低于对照组，证明血小板添加液保存的血小板完整性较血浆对照组好。以上结果均提示血小板保存在以血小板添加液替代65%自体血浆的混合液中与100%血浆中的效果相当。

总之，在10℃液态状态下，使用血小板添加液部分替代血浆保存单采血小板可使血小板的功能得到良好的保护，既延长了血小板的保存期限，又降低了血小板制品受污染的概率。虽然现阶段使用血小板添加液保存单采血小板的相关资料还比较少，但本研究数据提示，采用血小板添加液10℃低温保存单采血小板效果与传统的常温血浆保存方法相当，本研究将为血小板保存技术的发展提供一定的依据。

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