金乌骨通胶囊HPLC指纹图谱研究

1.黔南州食品药品检验所，贵州 都匀 558000；2.贵州省食品药品检验所，贵州 贵阳 550000

Abstract:ObjectiveTo establish the HPLC fingerprint of Jingwugutong Capsules and accumulate data for evaluation of its quality.MethodsThe chromatographic fingerprints were determined with RP-HPLC on Agilent Eclipse plus C18(4.6mm×250mm，5μm)and with the gradient solvent system consisting of acetonitrile(A)and 1% AcOH solution(B),0～15min,9～10%A,flow rate 1.0ml/min; 15～65min, 10～40%A, flow rate 1.0ml/min;65～115min,40～70%A,flow rate 1.5ml/min;115～125min,70%A,flow rate 1.5ml/min;the detection wavelength was set at:0～60min 254nm，60～85min 380nm，85～125min 254nm,and the column temperature was maintained at 30℃.ResultsBased on the peaks of icariin as reference peak, measured value of twenty nine batches revealed that there were thirteen common peaks and high similarity between samples of fingerprints.ConclusionIt is easy to handle for this method and has good separation effect, reproducibility, stability, precision, and can be applied to the quality control and the authenticity identification of Jingwugutong Capsules.

Keywords:Jingwugutong Capsules；HPLC；Fingerprint

金乌骨通胶囊是贵州省盛世龙方制药股份有限公司生产的制剂，由金毛狗脊、木瓜、乌梢蛇、葛根、淫羊藿、姜黄、补骨脂等多味药组成，具有滋补肝肾，祛风除湿，活血通络的功效。用于肝肾不足，风寒湿痹，骨质疏松，骨质增生引起的腰腿酸痛、肢体麻木等症[1]。

本实验采用反相高效液相色谱法，测定了29批样品，建立金乌骨通胶囊的指纹图谱检测方法，利用高效液相指纹图谱技术对药品生产环节质量进行监控和市场上真伪品的鉴别。此方法分离效果、精密度、稳定性、重现性等指标均表现良好。

1 仪器与材料

1.1 仪器 安捷伦1260高效液相色谱仪，自动进样器，DAD检测器。

1.2 材料与试药 乙腈(色谱纯)，水(娃哈哈纯净水)，其余试剂为分析纯；淫羊藿苷对照品(批号：110737-200415，中国药品生物制品检定所)；金乌骨通胶囊(盛世龙方制药有限公司提供、市场抽样)。

2 方法与结果[2]

2.1 色谱条件 色谱柱为安捷伦Eclipse plus C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-1%冰醋酸水溶液(B)，梯度洗脱程序为：0～15min，9～10%A，流速1.0ml/min；15～65min，10～40%A，流速1.0ml/min；65～115min，40～70%A，流速1.5mlL/min；115～125min，70%A，流速1.5ml/min；检测波长为0～60min为254nm，60～85min为380nm，85～125min为254nm；洗脱总时间为125min；柱温30℃；进样量20μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取淫羊藿苷对照品适量，加50%甲醇制成0.5mg/ml的溶液，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 避光操作。本品20粒，取内容物，研细，混匀，精密称取约0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，密塞，称定重量，置水浴回流30min，密塞放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3 系统适用性试验 取供试品溶液(批号130506)20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1)，样品共出峰24个，达到分离度要求的色谱峰个数为16个，对比保留时间确定供试品色谱中tR=49.2min峰为淫羊藿苷色谱峰，淫羊藿苷峰与相邻峰分离度达到要求，保留时间适中，选作参照峰(S)，确定13个共有峰，共有峰个数占总峰个数的比例为54%；3小时空针全光谱色谱图和3小时样品供试液全光谱色谱图表明色谱系统无其他干扰峰，组分在120min内出峰完全。

2.4 稳定性实验 取供试品溶液(批号130506)，分别于0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、30小时进样测定，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积比值的相对标准偏差，结果显示各共有峰相对保留时间的RSD为0.05%～1.27%，相对峰面积比值的RSD为0.26%～2.20%，结果说明供试品溶液在30小时内稳定性良好。

2.5 精密度实验 取供试品溶液(批号130506)，连续6次进样，记录色谱图，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积比值的相对标准偏差，结果显示各共有峰相对保留时间的RSD为0.06%～0.92%，相对峰面积比值的RSD为0.27%～2.33%，结果说明本方法精密度良好。

2.6 重复性实验 取供试品(批号130506)，依法操作，分别制备供试品溶液6份，进样测定，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积比值的相对标准偏差，结果显示各共有峰相对保留时间的RSD为0.04%～0.79%，相对峰面积比值的RSD为0.26%～2.57%，结果说明本方法重现性良好。

2.7 指纹图谱建立及相似度评价

测定连续4年生产的金乌骨通胶囊，共29批，建立指纹图谱，以参照峰保留时间计算各共有峰的相对保留时间及相对标准偏差，结果显示各共有峰的相对保留时间RSD均小于0.5%。结果见表1。

实验采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012.130723版本)软件来进行相似度评价，得到各批样品的相似度数据，结果见表2。

表1 29批金乌骨通胶囊共有峰相对保留时间

表2 29批金乌骨通胶囊指纹图谱相似度数据

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择 比较不同浓度甲醇溶液(20、40、50、60、80、100%)共6种提取溶剂对样品的提取效率，结果显示，甲醇浓度较低时，脂溶性成份提取不佳，反之则水溶性成份提取不佳，且甲醇浓度较高时，色谱峰溶剂效应明显，流出时间较短的色谱峰前伸严重，对分离度影响较大，经比较，确定提取溶剂为50%甲醇，此条件下，色谱峰丰富，峰形及分离效果良好。

3.2 流动相的选择 比较了乙腈-水、乙腈-醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液等多种不同组成、不同梯度溶剂系统。结果显示，按1.4项下洗脱溶剂系统实验得到的图谱峰形及分离度较好，故确定此梯度系统为流动相系统。

3.3 检测波长的选择 使用DAD检测器全波长扫描功能，在210～600nm波长范围内进行扫描，得到全光谱色谱图。根据3D谱图，确定检测波长为：0～60min，254nm；60～85min，380nm；85～125min，254nm。在此条件下，兼顾各峰强度，谱峰最为丰富。

3.4 实验注意事项 流出时间在75min附近的姜黄素类化合物具光敏性[3]，实验中发现其相对峰面积比值随时间呈缓慢下降趋势，因此实验过程应避光操作以控制其降解速率，获得可靠数据。

3.5 实验结果 连续4年共29批样品的指纹图谱相似度较高，稳定性、精密度和重现性好，指纹图谱具有一定特征性，可为金乌骨通胶囊的内在质量提供可靠的参考依据。

[1]WS-10140(ZD-0140)-2002．国家药品标准(试行)颁布件[S].

[2]何佳，李懿，韦建荣．宫血宁胶囊HPLC指纹图谱研究[J].中成药，2011，33(7)：1098-1101.

[3]王雪梅，陈利华，施文婷．姜黄素类化合物的光稳定性研究[J].安徽大学学报(自然科学版)，2012，36(3)：73-78.