基于MgPa模拟表位的MAP的制备、纯化与鉴定

(南华大学病原生物学研究所,湖南衡阳421001)

生殖支原体(Mycoplasma genitalium,Mg)是基因组最小的能自我复制的原核细胞型微生物,在男性主要引起急慢性非淋菌性尿道炎[1];在女性则引起慢性盆腔感染性疾病,并可导致不育[2];新生儿则经母亲生殖道分娩时感染引起结膜炎和肺炎[3]。Mg细胞膜上的黏附素蛋白(Mycoplasma genitaliumprotein of adhesion,MgPa)对Mg尖形结构的形成和Mg黏附到宿主细胞至关重要[4]。已有研究表明MgPa的C端(第1 248～1 364 aa)具有较强的免疫原性[5]。因此,Mg-Pa是一种重要的诊断和疫苗候选抗原。

课题组在前期的研究中制备并纯化了MgPa的多克隆抗体,以此抗体为靶分子,利用噬菌体展示肽库技术成功筛选到MgPa的3个模拟表位[6-8]。本研究拟以多聚赖氨酸为核心基质,制备含有MgPa 3个模拟表位的多抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP),并用反向高效液相色谱(reverse phase high performance liquid chromatography,HPLC)分析MAP的纯度,用质谱分析法测定其分子量以对MAP进行鉴定,以便为进一步研究基于 MgPa模拟表位的MAP用于Mg的临床诊断与预防提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 八分枝MAP的制备

分别合成含有参考文献[8]中P2、P30和P42所对应的多肽序列的八分枝MAP,为了使多肽序列与MgPa模拟表位的序列(P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P)中的第7位和第10位氨基酸一致,故将P2多肽序列中第7位的A改为R,第10位的K改为L。具体合成的序列如下所示：WP：(WPSAAERFSLSP)8-K4K2KG;AS：(AKITRTLSLPFS)8-K4K2KG 和KH：(KSLSRHDHIHHH)8-K4K2KG。

多肽的合成选用对称八分枝MAP树脂,采用标准的Fmoc方法[9]合成。选用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH为核心基质,2个Fmoc去掉以后暴露出2个氨基,分别都往下延伸。采取在一个Gly上接一个Lys,然后利用Lys的两个氨基再接2个Lys,再接4个Lys,然后在这4个Lys上的8个氨基上各接一条多肽,使其合成为八分枝MAP。

1.2 八分枝MAP的纯化

将合成好的八分枝MAP粗品溶解,经0.45 μm的纤维素膜过滤后,经Sephadex G-25凝胶渗透色谱法仔细纯化,冻干。最终产物用反相高效液相色谱仪(日本Shimadzu)鉴定其纯度,分析柱采用PLRP-S 100A为填料,流动相为含有0.1%三氟乙酸的乙氰溶液,流速为1 mL/min,波长为220 nm。

1.3 八分枝MAP的鉴定

为进一步验证合成的八分枝MAP是否确实与预期一致,委托上海吉尔生化有限公司对经RPHPLC鉴定纯度后的八分枝MAP进行质谱分析,以确定其相对分子质量。

2 结 果

2.1 八分枝MAP的合成

利用标准的Fmoc方法,选用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH为基质,以甘氨酸为肽和树脂间的连接物,首先合成寡聚赖氨酸基质,然后在寡聚赖氨酸基质上用固相逐步接肽法成功合成了3个含有模拟表位的八分枝MAP,具体合成的序列及结构如图1所示。

图1 合成八分枝MAP的结构 A：含WP12的MAP;B：含AS12的MAP;C：含KH12的MAP

2.2 八分枝MAP的RP-HPLC纯化

合成好的八分枝MAP粗品经过滤后,用RPHPLC分析并进行纯化,结果表明：WP12的主峰出现在保留时间为13.662 min处,其峰的面积占整个面积的91.850 1%,即其相对浓度约为91.850 1%(图2A)。AS12的主峰出现在保留时间为15.072 min处,其峰的面积占整个面积的93.348 1%,说明其相对浓度约为93.348 1%(图2B)。而KH12的主峰出现在保留时间为7.163 min处,其峰的面积占整个面积的94.526 5%,其相对浓度约为94.526 5%(图2C),以上这些结果说明所合成的MAP得到了较好的纯化,其纯度都达到90%以上。

2.3 八分枝MAP的质谱分析

用质谱分析仪对经RP-HPLC分析纯化后的八分枝MAP进行鉴定,结果显示：WP12的Mr约为11 880(图3A),AS12的 Mr约为10 532(图3B),KH12的Mr约为12 848(图3C),与理论预算值相符合。

3 讨 论

为了有效的预防Mg的感染,必须研制出能诱导产生中和抗体的疫苗。研究表明诱导机体产生中和抗体的表位多为构象表位,因此,不能通过抗原分子所具有的原始氨基酸序列进行预测。而鉴定构象表位的模拟表位是解决这一难题的方法之一。Geysen把模拟表位定义为：一个能与抗体分子的抗原结合位点结合,未必与诱导该抗体的表位相同,但可模拟该表位基本特征的分子[10]。一个表位和其相应的模拟表位有相同的抗原性,其中可能的原因有如下两点：①两者结合于抗体同一互补位中不同抗原结合位点;②两者具有相同的原子。课题组在前期研究中利用噬菌体展示肽库技术筛选到MgPa的3个模拟表位,含有这些模拟表位的噬菌体能和MgPa的多克隆抗体特异性结合。

图2 用RP-HPLC分析3个MAP的纯度 A：RP-HPLC分析WP12的纯度;B：RP-HPLC分析 AS12的纯度;C：RP-HPLC分析KH12的纯度

图3 质谱分析法鉴定制备的3种MAP A：含WP12序列的MAP;B：含AS12序列的MAP;C：含KH12序列的MAP

一般来说,免疫细胞识别、递呈抗原时仅需要十几个氨基酸,与抗体结合则仅需要几个关键的氨基酸[11]。因此,表位肽疫苗利用含较短氨基酸序列的免疫优势抗原表位,即可有效地被免疫系统识别和被APC递呈,具有针对性强、能去除抑制性表位和避免因病原体发生抗原变异而引起的免疫逃逸等优点。但在实际应用中,由于表位肽疫苗在结构方面存在一定缺陷,并不能有效的诱导体内的免疫反应,必须对其构型进行改建以增添分子修饰才能提高其免疫原性及其在体内的稳定性。Tam等[12]采用具有α和ε两个氨基、分子量小、且免疫原性弱的赖氨酸为核心基质,将4条或8条抗原表位相同或不同的单体肽偶联在一起,形成树枝状结构,称之为MAP。与线性多肽相比,MAP具有以下优点：①能提供更多的抗原表位,因而能与抗体多价结合;②能很好的模拟天然表位的构象,诱导机体产生更多的保护性抗体,且能减少氨基酸变异的影响;③能更好地提供抗原表位与抗体结合的空间,增强肽的表位结合能力,提高了APC对抗原肽的识别、处理和提呈效率;④相对分子质量较大,由于抗原表位的重新搭配和组合能提高其免疫原性,因此,无需分子修饰或偶联载体蛋白。因此,MAP已用于HIV[13]、流感病毒[14]等病原体的新型诊断抗原和疫苗研究,显示出其独特的优越性。吴玉章等[15]在实验中发现,合成的含有Pre-S2序列的MAP肽诱发的免疫反应明显高于对照的线性肽,说明MAP肽的结构能明显提高抗原肽的免疫原性,从而间接说明分枝肽结构可能部分恢复其大分子特征。

本研究用Fmoc法合成了前期研究中筛选并经鉴定的MgPa的3个模拟表位的MAP,RP-HPLC分析的结果表明,合成的3种MAP的纯度均达到了90%以上,然后用质谱分析对其进行了鉴定,3种MAP的分子量与预期分子量相符,说明成功的合成了含有3个模拟表位的MAP。下一步将把这些经鉴定的MAP分别免疫小鼠,检测其诱导小鼠产生特异性体液免疫与细胞免疫应答的水平,以便研究基于模拟表位的MAP在临床诊断和疫苗研究中的应用价值。

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