二苯乙烯苷对大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生的作用

(南华大学附属第二医院血管外科,湖南衡阳421001)

下肢动脉硬化闭塞症(arteriosclerosis obliterans,ASO)是严重威胁人类生命以及影响病人生活质量的动脉性疾病,其主要临床症状表现为间歇性跛行、明显疼痛和缺血性肢体溃疡等。目前治疗下肢动脉硬化闭塞症的方法有很多,如球囊扩张术、支架植入术、旁路手术等方法,但ASO的远期效果却欠佳,主要原因是手术后血管的再狭窄(restenosis,RS)。文献[1-2]报道,旁路血管再狭窄其远期发生率可高达40%,球囊扩张对于狭窄性病变的3年通畅率为61%,闭塞性病变的3年通畅率为48%[3];因此,降低血管再狭窄的发生率、提高血管远期通畅率,改善病人生活质量是每位血管外科医生面临的严峻问题。再狭窄的发生机理是血管外科领域研究的难点和热点,目前普遍认为其发生与血栓的形成、炎症、平滑肌细胞迁移增殖、基质沉着和血管的重塑关系密切,其中血管平滑肌细胞向内膜迁移增殖导致内膜增厚是再狭窄的主要病理改变[4]。何首乌水溶性成分2,3,4′,5-四羟基二苯乙烯-2-O-B-D葡糖苷(简称二苯乙烯苷,2,3,4′,5-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG)是何首乌的主要药效成分,药理作用十分广泛,可通过改善脂质代谢、抗氧化、抗炎、抑制血小板聚集和血管平滑肌细胞增殖等途径而达到防治动脉粥样硬化的作用[5];但对于血管狭窄的影响未见报道。本研究旨在利用大鼠颈动脉球囊损伤模型,观察二苯乙烯苷(TSG)对损伤后血管内膜增生及细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)表达的影响,探究其作用机制,以期为临床防治血管再狭窄的药物研发提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Wistar大鼠由南华大学动物实验部提供。二苯乙烯苷由南京泽朗医药科技有限公司提供。2.0F Fogarty球囊导管购自美国Boston Scientific公司。免疫组化试剂盒和ERK抗体购自武汉博士德公司。

1.2 动物分组及颈总动脉损伤模型制备

参照Lindner等[6]方法,通过2.0F Fogarty球囊导管扩张制造大鼠颈总动脉损伤模型。54只体重350～400 g,10～12周龄的雄性SD大鼠被随机分成3组：假手术组、手术组和TSG组,每组18只。假手术组仅做手术分离颈动脉;而手术组和TSG组球囊拉伤颈动脉;TSG组术前1周开始每天120 mg/kg灌胃,1次/天,给药容量为每100 g大鼠1 mL,直至术后相应时间点;同时手术组和假手术组用生理盐水灌胃,容量和次数均和TSG组相同。普通饲料喂养,饮水不限。分别于术后第7天、14天和21天取出左颈总动脉标本。

1.3 标本处理

在大鼠术后第7天、14天、21天,每组各取6只大鼠,腹腔注射300 mg/kg、浓度为10%的水合氯醛麻醉,迅速取左侧颈总动脉,用4%多聚甲醛溶液固定12 h,经常规梯度乙醇溶液脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,以5 μm厚度切片,然后分别进行苏木精-伊红(HE)染色。

1.4 HE染色及图像分析

石蜡切片经常规脱蜡及复水后行HE染色。在光镜下观察血管内膜增生情况,利用计算机图像Image-Pro Plus 6.0软件分析血管内膜(intimal)和中膜(membrane)横断面的面积,计算内膜/中膜面积比(I/M),以内弹力膜区别内膜和中膜,测量采用单盲法,测量者为与本实验无关者。

1.5 免疫组化法测定细胞外信号调节激酶(ERK)

一抗小鼠抗大鼠ERK多克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供。石蜡组织切片经脱蜡、复水,加入过氧化氢灭活内源性过氧化物酶,浸入枸橼酸盐缓冲液,用微波炉加热进行抗原修复,加封闭液封闭,加一抗p-ERK1/2(#4377,购自Cell signaling公司)孵育,用PBS冲洗,加二抗(#sc-2004,购自Santa Cruz公司)孵育,再用PBS冲洗,以3、3p二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木精复染。在光镜(400倍)下观察细胞胞核或胞浆黄染的阳性细胞及血管内膜增生情况。

1.6 Western Blot检测ERK

每个血管组织样本中加入预冷RIPA裂解缓冲液,冰上匀浆离心后吸取上清,BCA法测定蛋白浓度;各组取等量蛋白提取液于沸水浴中加热5 min,自然冷却后加入上样缓冲液在100 V恒压条件下,经10%的SDS-PAGE胶电泳分离,电泳结束后,把凝胶电转移至PVDF膜上。在室温条件下用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h,再与抗ERK抗体(1:500)4℃反应过夜。室温条件下TBST震荡洗膜共3次,再用HRP标记的相应二抗(1:5 000)室温反应2 h,PVDF膜TBST充分洗涤3次后应用ECL化学发光法显影,暗室内压片、显影、定影。置于 AlphaImager2200灰度扫描软件进行密度分析。

1.7 统计学分析

用SPSS16.0统计软件对实验数据进行统计学分析,用±s来表示实验数据。采用One-way分析对均数进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 二苯乙烯苷延缓血管损伤后内膜增生

分别在术后第7天、14天和21天,光镜下观察颈总动脉的病理形态学改变(图1),假手术组术后第7天、14天和21天未见新生内膜形成,未见管腔狭窄;手术组术后各时间点损伤部位血管均见大量新生内膜形成,内膜明显增厚,血管管腔狭窄,血管壁明显增厚,血管平滑肌细胞排列稳乱,并且14天时血管内膜增厚达到高峰,14天后内膜可继续增厚;TSG组术后各时间点血管内膜增厚和血管管腔狭窄等均较手术组显著减轻。说明二苯乙烯苷可以抑制血管损伤后内膜增生(表1)。

图1 术后第7天、14天和21天各组血管病理形态学改变(HE,×400)

表1 二苯乙烯苷延缓血管损伤后内膜增生(内膜中膜面积比)

2.2 二苯乙烯苷对损伤血管壁pERK1/2表达的影响

pERK1/2主要表达于胞浆中,其阳性表达呈棕黄色。图2结果显示：在术后各时间点,假手术组均未见pERK1/2表达增高(P＜0.05);手术组术后各个时间点血管损伤部位pERK1/2表达均明显增高(P＜0.05);而TSG组术后各时间点血管损伤部位pERK1/2表达均明显低于手术组(P＜0.05)(表2)。

图2 术后第7天、14天和21天各组血管pERK1/2的表达(SABC法,×400)

2.3 二苯乙烯苷对损伤血管壁pERK1/2表达的影响

分别在术后第7天、14天和21天,用Western Blot测定损伤部位血管组织中pERK1/2的表达(图3)。图像分析结果显示：手术组术后各个时间点血管损伤部位pERK1/2蛋白表达量均明显高于假手术;而TSG组术后各时间点血管损伤部位pERK1/2表达均明显低于手术组。

3 讨 论

血管术后再狭窄的防治已成为研究热点,手术过程中不可避免地出现内皮的损伤和剥脱,而内皮损伤是再狭窄发生的始动因素,在由损伤刺激所激活的多种转录因子、生长因子和细胞因子等共同作用下,血管平滑肌细胞(vascular smoothmuscle cell,VSMC)表型发生转化向内膜下迁移增殖,并进一步分泌大量的细胞外基质,从而形成新生内膜,导致管腔狭窄[7-8],其中血管平滑肌细胞向内膜迁移增殖导致内膜增厚是再狭窄的主要病理表现[4]。动物实验和临床研究证明如果抑制新生内膜形成,可以预防再狭窄[9-10]。

VSMCs的增殖受多种生长刺激因子和抑制因子的双重调节,在VSMCs的增殖过程中这些因子通过多种信号转导通路彼此间形成复杂的调节网络[11-12]。其中,有丝分裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinases,MAPK)在此病理生理过程起着重要的作用[13],而在MAPK家族中参与增殖最主要的成员是细胞外信号调节激酶(ERK),ERK包括ERK1和ERK2两种异构体(分子量分别为p44和p42)。这两种异构体具有相似的激活动力学、细胞定位和底物,在大多数情况下它们的功能相似。Ras/Raf/MEK/ERK是ERK通路的主要途径[14];当血管损伤后,多种生长因子持续激活Ras蛋白,活化的Ras作为衔接蛋白与Raf结合,将Raf从细胞质转移到细胞膜[15]。进而激活 MEK,使ERK磷酸化而活化,再通过磷酸化下游底物分子进而调节细胞周期,使血管平滑肌增生迁移至内膜,再次大量增殖并合成分泌细胞外基质,从而导致内膜增生狭窄[16]。ERK 1/2激活后,能激活下游转录因子如 Jun、Fos等,进而诱导 cyclinD的表达,促使CDK4和CDK6形成复合体,使细胞从G1期进入S期。有研究表明,在球囊损伤血管后,用不同的方法检测ERK1/2的表达,可以检测到ERK1/2的活性升高[17]。本实验在球囊损伤血管后第7天、14天和21天分别用免疫组织化学染色方法和蛋白免疫印迹法检测损伤血管组织中ERK1/2的表达,得到了同样的发现,手术组ERK1/2的表达明显增高,具有统计学意义。

图3 WesternBlot检测术后第7天(A)、14天(B)、21天(C)血管中pERK1/2的表达(n=3)

何首乌为蓼科植物,何首乌提取的最重要的有效成分是二苯乙烯苷(TSG),它是一种白色粉末,易溶于水。因此本实验利用二苯乙烯苷良好的水溶性,每天按TSG给药剂量为120 mg/kg、给药容量为生理盐水1 mL/100 g大鼠给予灌胃。张伟等[18]分别用30、60、120 mg/kg TSG对As模型SD大鼠灌胃处理,发现120 mg/kg TSG组抑制炎症反应及保护内皮细胞方面最为显著。

在体外实验抑制血管平滑肌细胞方面,许晓乐等[19]研究显示,在血清刺激下G0/G1期的细胞明显减少,进入S期、G2/M期的细胞增多,表明细胞增殖活跃。用TSG处理组与10%FBS组相比,G0/G1期比例明显增高,S期细胞减少。上述研究提示二苯乙烯苷抑制VSMCs增殖可能是阻止了VSMCs通过细胞周期中的G1/S限制点,使其不能进入S期来实现的。Chen等[20]研究显示,TSG可抑制血小板衍生生长因子(platelet-derived growthfactor,PDGF)诱导的小牛血管平滑肌细胞增殖。而TSG抑制血管平滑肌细胞增殖及迁移的体内实验方面相对较少,且能否抑制血管损伤后内膜的增生?本实验在术后第7天、14天和21天分别取假手术组、手术组、TSG组左颈总动脉标本进行HE染色,光镜下观察,发现TSG组血管损伤部位内膜增殖及管壁增厚,管腔缩小均明显低于手术组,并具有统计学意义,这一结果说明了TSG能够抑制血管损伤后内膜的增生。那么这一结果是否又和ERK1/2有关呢?本实验在术后第7天、14天和第21天用免疫组织化学染色方法检测各组血管ERK1/2的表达,结果显示：TSG组pERK1/2的表达均明显低于手术组,这一结果提示二苯乙烯苷抑制血管损伤后内膜增生的机制可能与抑制ERK活化有关。本实验再用Western Blot方法检测各组血管中pERK1/2蛋白的表达,进一步证实了其抑制作用可能与ERK的活化有关。通过上述实验研究,提示二苯乙烯苷可以延缓血管损伤后内膜增生,并且其机制可能与抑制ERK活化有关。

二苯乙烯苷作为传统中医药,具有十分广泛药理作用,且价格低廉,随着研究的深入,其在预防动脉粥样硬化、再狭窄、血管内膜增厚中的作用将有着较广泛的前景,可能会发展成为一种新型的治疗药物。

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