研究环孢菌素A对再障病患骨髓细胞Fas表达及凋亡率的影响

刘珂

研究环孢菌素A对再障病患骨髓细胞Fas表达及凋亡率的影响

刘珂①

目的：研究环孢菌素A（CsA）对再生障碍病患骨髓细胞Fas表达及凋亡率的影响。方法：从2010年2月-2013年2月，本院共计48例病患被确诊为再障。以数字法随机分成观察组24例和对照组24例，对照组以注射用丹参治疗，观察组在此基础上另以CsA治疗。对比两组疗效，分析CsA对于再障病患骨髓Fas表达情况和对MNC有关凋亡率影响。结果：观察组总有效率为83.33%（20/24），显著高于对照组的37.50% （9/24），比较差异有统计学意义（P＜0.05）。两组在治疗前后CD34+Fas+的细胞百分率相比，差异无统计学意义。观察组病患骨髓CD34-细胞的Fas表达和对照组相比，差异无统计学意义。观察组治疗后MNC有关凋亡率为（2.27±0.74）%，显著低于治疗前的（6.58±2.33）%，以及对照组治疗后的（2.92±1.20）%，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：细胞Fas异常表达和再障发病情况有一定联系，以CsA治疗再障病患，可明显降低其骨髓MNC凋亡率，疗效显著，值得临床推荐。

环孢菌素A； 再障； 骨髓细胞； Fas表达； 凋亡率

再生障碍性贫血是一种骨髓造血干细胞和/或造血微环境损伤性血液病。其免疫机制发生紊乱损伤，及造血干细胞和骨髓的微环境发生损害等因素均为该病主要机制[1]。因此在治疗该病时，免疫抑制疗法可作为一类主要手段。同时，近年来有报道表明，Fas/ FasL系统可有效诱导凋亡，其不仅和正常造血相关，亦和造血病理及生理状态相关，此系统和再障病患免疫发病有关机制有着一定联系，有学者认为细胞凋亡的增加是再障疾病重要性病理和生理机制，但此方面报道较少[2]。鉴于此，本文通过以环孢菌素A（CsA）药物治疗再障病患，分析其对病患骨髓细胞Fas的表达和凋亡率情况影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从2010年2月-2013年2月，本院共计有48例病患被确诊为再障。其中男26例，女22例。年龄17～64岁，平均（37.2±2.8）岁。含慢性再障（以下简称为CAA）者24例；重型再障（以下简称为SAA）Ⅰ型者15例，Ⅱ型者9例。以数字法随机分成观察组24例和对照组24例。观察组男13例，女11例，年龄17～63岁，平均（37.1±2.7）岁，CAA者12例，SAAⅠ型者7例，Ⅱ型者5例。对照组男13例，女11例，年龄18～64岁，平均（37.5±1.7）岁，CAA者12例，SAAⅠ型者6例，Ⅱ型者6例。两组性别，年龄以及疾病类型等方面对比，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 对照组以注射用丹参（哈药集团）治疗，规格为2 mL/支，一次用4 mL，治疗3个月。观察组在此基础上加用环孢菌素A（新山地明，瑞士的SADONA公司，规格为25 mg/粒）。初始剂量是每天2.5 mg/kg，服用3个月。两组病患在治疗期间需定期检测血常规，以及肝﹑肾功能等。

1.3 疗效评价标准 根据张之南主编有关血液病诊疗标准判定[3]，分为明显缓解﹑进步和无效，总有效率=（明显缓解+进步）/总例数×100%。

1.4 观察指标 分别在治疗前以及治疗3个月后采集病患新鲜的骨髓标本计2～4 mL，而肝素抗凝以淋巴细胞有关分离液将单个核细胞（即MNC）进行分离，将细胞浓度予以调整到1×107mL，以分析凋亡率和Fas检测。CD34和Fas标记以直接免疫法进行，抗体是抗CD34-PE，及抗Fas-FITC（产于Pharmingen公司）。以流式细胞仪（FACS Vantage BD公司生产）进行测定。而细胞凋亡率测定以Boehringer Mannheim公司所产的原位末端标记（即TUNEL）法进行。根据有关说明书严格执行测定操作，确保结果准确。

1.5 统计学处理 使用SPSS 13.0软件分析，计数资料比较采用 χ2检验，计量数据采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组疗效比较 观察组总有效率为83.33% （20/24），显著高于对照组37.50%（9/24），比较差异有统计学意义（χ2=10.541，P＜0.05）。观察组明显缓解4例，占比16.67%，对照组明显缓解2例，占比8.33%。

2.2 CsA对于再障病患骨髓细胞Fas表达情况影响两组治疗前后CD34+Fas+的细胞百分率相比，差异无统计学意义。同时，观察组病患骨髓CD34-细胞的Fas表达和对照组相比，差异亦无统计学意义。见表1。

表1 CsA对再障病患骨髓细胞Fas表达情况影响（±s） %

表1 CsA对再障病患骨髓细胞Fas表达情况影响（±s） %

+Fas+CD34-Fas+组别 CD34治疗前 治疗后 治疗前 治疗后观察组（n=24） 40.53±7.33 37.92±4.52 51.42±13.44 52.65±10.67对照组（n=24） 39.08±6.86 38.83±7.89 50.82±14.35 47.83±13.86 t值 0.078 0.490 0.150 1.350 P值 0.483 0.626 0.882 0.184

2.3 CsA对于再障病患骨髓MNC有关凋亡率影响 观察组治疗前后MNC有关凋亡率分别为（6.58±2.33）%﹑（2.27±0.74）%，对照组分别为（6.46±2.17）%﹑（2.92±1.20）%，观察组治疗后MNC有关凋亡率显著低于治疗之前和对照组治疗后，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

异常免疫造血抑制是再障最常见的病理生理机制[4-5]。通常而言，CsA的化学结构为环寡肽，由一种真菌产生的具有生理活性的代谢产物，是一种特异性较强的免疫抑制剂[6]。可通过封闭T淋巴细胞表面受体，阻断T移植细胞活化和增殖反应等机制发挥作用[7]。CsA作为一类免疫抑制剂，其特异性比较高，经十一个氨基酸构成环形多肽[8]。其对于治疗再障而言是一种有效药物。据有关报道表明，1995年第37届美国的血液学年会指出，以CsA对再障进行治疗，有效率为50%～60%，且病患在血液学指标的改善上通常开始于用药之后3个月中[9]。故本文选择在治疗前以及治疗3个月时对有关指标实施测定。经研究发现，观察组总有效率为83.33%，显著高于对照组的37.50%。同时治疗后观察组明显缓解4例，占比16.67%，对照组明显缓解2例，占比8.33%，表明观察组CsA治疗方案疗效更佳。符合Xiao等[10]报道结果。这可能和CsA可通过对T细胞进行抑制，从而促使T细胞亚群比例产生变化而恢复造血有关[11]。

此外，两组在治疗前后CD34+Fas+的细胞百分率相比，差异无统计学意义；同时，观察组病患骨髓CD34-细胞的Fas表达和对照组相比，差异亦无统计学意义，提示以GsA治疗后，并不影响Fas抗原的表达。但笔者在研究中发现，再障病情的不同，Fas表达结果亦不尽相同，SAA病患相应CD34+Fas+的细胞百分率会高于CAA病患，而根据本院正常体检者有关资料，无论是SAA还是CAA病患，其CD34+Fas+的细胞百分率均高于健康人群，这也从侧面反映了Fas和再障免疫发病机制有一定关联。进一步研究表明，CD34+Fas+的细胞百分率和骨髓细胞的凋亡率可呈现正相关联系（SAA病患r=0.624，P＜0.05；而CAA病患r=0.631，P＜0.05）。

笔者在研究中还发现，观察组治疗后MNC有关凋亡率为（2.27±0.74）%，显著低于治疗前的（6.58±2.33）%，以及对照组治疗后的（2.92±1.20）%。与朱琳超等[12]报道一致，表明以CsA治疗方案治疗再障，可明显减少骨髓MNC凋亡。这可能是因为再障为骨髓的造血功能发生衰竭引发全血细胞数量减少，无论其初始病因怎样变化，造血干细胞的数量减少即为其基本特征。目前不但已经观察到再障患者体内T淋巴细胞亚群分布异常﹑肿瘤坏死因子和白介素-2等负调控因子活性增高等免疫紊乱现象，而且能够从患者骨髓内分离出攻击CD34+细胞的T淋巴细胞克隆[13]。而CsA能够降低某些因促凋亡因素而减少损伤骨髓，抑制活化T细胞有关功能，减少对Fas高表达的CD34+细胞攻击，最终对其有关造血功能有明显改善[14-15]。笔者在研究过程中，以TUNEL方法进行检测发现再障病患MNC的凋亡率整体而言处于增高趋势，在治疗之后又下降，这证实细胞凋亡于再障疾病中的影响作用。需要指出的是，由于研究样本量较少，所得结果仍需大样本进一步验证，进而寻找深入因素，为彻底对再障疾病进行治愈而努力奋斗。

综上所述，细胞Fas异常表达和再障发病情况有一定联系，以CsA治疗再障病患，可明显降低其骨髓MNC凋亡率，疗效显著，值得临床推荐。

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Research on the Influence of Cyclosporin A to Patients with Aplastic Anemia’s Marrow Cells Fas Expression and Apoptosis Rate

/LIU Ke.//Medical Innovation of China，2014，11（16）：063-065

Objective：To study the influence of Cyclosporin A （CsA） to patients with aplastic anemia’s marrow cells Fas expression and apoptosis rate.Method：From February 2010 to February 2013， in our hospital a total of 48 patients were diagnosed with aplastic anemia， who were digital randomly divided into observation group （24 cases） and control group （24 cases）. The control group was treated with salvia injection， the observation group on the basis of it was treated with CsA. To compare the curative effect of the two groups， and analyze the influence of CsA to patients with aplastic anemia’s marrow cells Fas expression and apoptosis rate.Result：The total effective rate of the observation group was 83.33% （20/24）， which was significantly higher than that of the control group 37.50% （9/24）， and difference was statistically significant （P＜0.05）. To compare both the two groups before and after treatment of CD34+Fas+cell percentage， the difference was not statistically significant. To compare the observation group’s Fas expression of bone marrow CD34-cells with the control group， the difference was not statistically significant. The observation group after treatment’s MNC apoptosis rate was （2.27±0.74）%， which was significantly lower than （6.58±2.33）% before treatment， and （2.92±1.20）% of the control group after treatment， the differences were statistically significant （P＜0.05）.Conclusion：The abnormal expression of Fas has some contact with the incidence of aplastic anemia. Using CsA to treat patients with aplastic anemia can significantly reduce the bone marrow MNC apoptosis rate. It has a significant effect and is worthy of recommendation.

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.16.020

2014-04-08） （本文编辑：王宇）

①河南科技大学第一附属医院 河南 洛阳 471003

刘珂

【Key words】Cyclosporin A； Aplastic anemia； Bone marrow cells； Fas expression； Apoptosis rate

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of He’nan University of Science and Technology，Luoyang 471003， China