葛花原花青素的酶法提取及抗氧化性研究

李银花，李洪燕

(1.广东食品药品职业学院，广东广州510520;2.广州市质量监督检测研究院，广东广州510110)

葛花为豆科葛属落叶藤本植物的花朵，是我国传统的药食两用植物，在我国资源丰富，特别是在广西、云南、四川、福建、台湾等地已有广泛种植［1］。葛花富含多种生理活性物质，例如黄酮、多糖、氨基酸、微量元素等［2］，它们表现出较多的生理活性，例如影响特异基因表达、保护心血管及抗癌等［3－5］。葛花的开发研究与综合利用是目前研究的焦点之一，但是葛花中原花青素产品的提取、开发、综合利用等还鲜有报道，同时如何高效的提取葛花中的原花青素也还有待研究。原花青素(procyanidins，PC)是一种具有特殊分子结构的生物类黄酮，它由黄烷－3－醇和黄烷－3，4－二醇的配位缩合或聚合而成的低聚或多聚物［6］。原花青素由于其特殊、多样的分子结构，因此具备抗衰老、抗氧化、抗糖尿病、抗肿瘤、抗菌等多种生理活性及药理作用［7］。它广泛存在于自然界中，目前原花青素主要来从葡萄籽、松树皮中提取，提取原花青素来源单一，无法满足社会的需要。

传统的原花青素提取方法主要是水浸提法［8］和有机溶剂提取法［9］等。传统的提取方法不但提取时间很长，而且提取温度高，会严重影响原花青素组成。酶法提取是一种优良的提取方法，它利用相应的酶破坏植物细胞，促进有效物质的快速溶出。酶法提取不仅操作简便迅速，并能在一定的程度上提高提取率，目前已广泛应用在生物活性物质提取方面［10－11］。在研究中采用酶法提高葛花中原花青素的含量及提取效率，并采用响应曲面法优化提取工艺，分析纤维素酶、果胶酶、酶解时间及酶解温度对葛花原花青素提取率的影响，并建立数学模型。此外，利用Sephadex LH－20凝胶柱对葛花原花青素进行纯化，分析其体外抗氧化活性，为葛花的综合开发与利用提供理论及技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛花药材 由广州二天堂药店提供，广东省中药研究所鉴定为粉葛(P.thomsonii Benth)的花，烘干磨粉后，过20目筛于冰箱冷藏备用;儿茶素标准品、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司;乙醇、甲醇、香兰素均为分析纯。

KQ－SOOB型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;THZ－82恒温振荡器 国华企业;752－紫外分光光度计 上海分析仪器厂;N－1001真空旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司;电子分析天平 梅斯特－拖利多仪器上海有限公司;CF16RXII高速冷冻离心机 日立。

1.2 实验方法

1.2.1 葛花原花青素的酶法提取 准确称取预先处理好的葛花粉2.0g于锥形瓶中，加入20mL蒸馏水，加入纤维素酶、果胶酶在一定温度下作用一定时间，过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干大部分水分，余下的滤液加入60%的乙醇溶液至20mL，在60℃条件下提取2h，过滤、浓缩，定容，得提取液。将提取液稀释一定倍数，测定原花青素的含量。

1.2.2 葛花原花青素提取工艺优化 单因素实验:果胶酶添加量0.4%，酶解时间2h，酶解温度50℃的条件下，考察纤维素酶添加量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%)对原花青素得率的影响。纤维素酶添加量0.4%，酶解时间2h，酶解温度50℃的条件下，考察果胶酶添加量(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%)对原花青素得率的影响。纤维素酶添加量0.4%，果胶酶添加量0.6%，酶解温度50℃的条件下，考察酶解时间(30、60、90、120、150min)对原花青素得率的影响。纤维素酶添加量0.4%，果胶酶添加量0.6%，酶解时间90min的条件下，考察酶解温度(35、45、55、65、75℃)对原花青素得率的影响。分别研究纤维素酶添加量(X1)、果胶酶添加量(X2)、酶解时间(X3)和酶解温度(X4)对提取效果的影响。在单因素实验的基础上，利用Box－Behnken中心组合实验进行实验设计，用Design Expert 8.0软件进行响应面优化分析，确定最佳提取工艺。因素水平编码表如表1所示。

表1 响应曲面实验设计因素水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface experimental design

1.2.3 原花青素含量的测定 采用香草醛－盐酸法［12］测定提取液中原花青素含量。以儿茶素标准品绘制标准曲线，测定提取液中原花青素的含量，按下式计算得率:

以儿茶素为标准品，分别配制浓度为50，100，150，200，250，300μg/mL的标准液，绘制标准曲线。得到回归方程Y=0.003X+0.0433，R2=0.9945。

1.2.4 葛花原花青素的纯化 在最优工艺条件下提取葛花原花青素，对提取液进行浓缩，3000g离心15min，收集上清液，去除沉淀。将上清液旋转蒸发浓缩至一定体积，经 0.45μm滤膜过滤，上样至Sephadex LH－20凝胶柱。用50%甲醇洗脱至洗脱液无色，再用500mL 70%的丙酮溶液洗脱，收集丙酮洗脱部分，将洗脱液真空浓缩、冷冻干燥，得到原花青素，于－20℃冰箱中储藏备用，同时测定原花青素的含量。

1.2.5 葛花原花青素的体外抗氧化活性

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 参考Villaño［13］等人的方法，略作修改。取不同浓度的原花青素溶液0.1mL，加入3.9mL质量浓度为25mg/L的DPPH甲醇溶液中，摇匀，反应30min。在515nm处测吸光度。以VC作为对照。将IC50值定义为，DPPH自由基清除率达到50%时原花青素样品的浓度。

按下式计算DPPH自由基清除率:

其中，A0为空白组吸光值，A1为样品组吸光值。1.2.5.2 羟自由基清除能力 参考 Smimoff等人［14］的方法。取不同浓度的样品0.5mL，依次加入1.5mL 2.0mmol/L的FeSO4溶液，1.5mL 6.0mmol/L的H2O2溶液，1.5mL 6.0mmol/L的水杨酸溶液。37℃反应30min后冷水冷却。510nm处测吸光度。以VC作为对照。将IC50值定义为，羟自由基清除率达到50%时原花青素样品的浓度。

羟自由基清除能力按下式计算:

其中，A0为空白组吸光值，A1为样品组吸光值，A2为试剂空白的吸光值。

1.2.5.3 超氧阴离子自由基清除能力 参考Li［15］的方法。50μL不同浓度的样品溶液与2900μL的pH 7.4的Tris－HCl缓冲液(0.05moL/L，37℃)混合，加入50μL邻苯三酚溶液(25μL 6.0mmol/L邻苯三酚溶液与25μL 1mmol/L HCl溶液混合)，迅速混匀，37℃下反应，在325nm下测定反应5min时吸光度的变化，计算超氧阴离子自由基清除能力。以VC作为对照。将IC50值定义为，超氧阴离子自由基清除率达到50%时原花青素样品的浓度。

按下式计算超氧阴离子自由基清除能力:

超氧阴离子自由基清除率(%)

其中，ΔAcontrol为空白组吸光度的变化，ΔAsample为样品组吸光度的变化，T为测定时间，即5min。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 纤维素酶对原花青素得率的影响 图1说明，在纤维素酶添加量小于0.4%时，原花青素得率随纤维素酶添加量的增加而增加;在纤维素酶添加量达到0.4%时达最大，之后随着纤维素酶添加量的增加反而呈下降趋势。这可能由于当酶浓度提高到一定值后，底物浓度对酶不能达到饱和，导致酶的作用受到抑制［16］。因此，纤维素酶添加量选择在0.2%～0.6 %为宜。

图1 纤维素酶添加量对原花青素得率的影响Fig.1 Effect of cellulase on extraction of PC

2.1.2 果胶酶对原花青素得率的影响 由图2可知，随着果胶酶添加量的增加，原花青素得率逐渐增大，在0.6%左右达到最高。当果胶酶添加量超过0.6%后，原花青素得率逐渐下降。因此果胶酶添加量选择在0.4%～0.8%为宜。

图2 果胶酶添加量对原花青素得率的影响Fig.2 Effect of pectase on extraction of PC

2.1.3 酶解时间对原花青素得率的影响 酶解时间太短影响酶解效果，太长则不利于工业生产。由图3可知，30～90min内原花青素得率随着时间的增加而逐渐增大，这是因为随着酶解时间的延长，酶解反应进行较为完全，原花青素更能有效溶出，使得原花青素得率增大。进一步延长酶解时间，得率反而降低，且会增加能耗，不利于生产。因此酶解时间选择在60～120min为宜。

图3 酶解时间对原花青素得率的影响Fig.3 Effect of enzyme time on extraction of PC

2.1.4 酶解温度对原花青素得率的影响 由图4可知，随着酶解温度的升高，原花青素的得率不断增加，到65℃左右达到最高;继续升高温度，得率反而下降。说明温度的升高对酶的作用有促进作用，这可能是由于较高的温度使得酶活性增强，反应速度加快;但温度过高会使酶活性减弱，酶的稳定性降低，同时高温会破坏原花青素的结构，导致得率下降，因此提取温度不宜过高。综上，酶解温度选择55～75℃为宜。

图4 酶解温度对原花青素得率的影响Fig.4 Effect of enzyme temperature on extraction of PC

2.2 响应曲面实验结果

响应曲面实验设计及结果见表2。

表2 响应曲面实验方案及结果Table 2 The design matrix andthe corresponding results of RSM experiments

利用Design－Expert软件对表2实验结果进行回归分析，得到回归方程:

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

对模型进行方差分析，结果见表3。由表3可知，模型的显著水平远远小于0.05，说明模型效应显著;失拟项p=0.5833＞0.05，说明方程对实验的拟合度较好。显著性分析可知，X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X12、、X32、对原花青素得率的影响显著，说明纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解时间及酶解温度对原花青素得率的影响均达显著水平。交互项中，纤维素酶添加量与果胶酶添加量、纤维素酶添加量与酶解时间、果胶酶添加量与酶解时间、果胶酶添加量与酶解温度之间的交互作用显著，而其他因素之间的交互作用不显著。由F值可知，各因素对葛花原花青素得率影响的显著性由大到小依次为X2(果胶酶添加量)＞X3(酶解时间)＞X1(纤维素酶添加量)＞X4(酶解温度)。

利用Design－Expert软件中的响应面和等高线图对4因素间的交互作用进行分析，结果如图5～图10所示。

在酶解时间90min，酶解温度65℃时，纤维素酶添加量和果胶酶添加量的响应面和等高线如图5所示。由图可知，纤维素酶添加量不变时，果胶酶对原花青素得率的影响呈先增大后减小的趋势。而当果胶酶不变时，随着纤维素酶添加量增大，原花青素的得率逐渐增大，之后略微降低。由方差分析结果可知，两者交互作用显著。

图5 纤维素酶添加量和果胶酶添加量的响应面Fig.5 Response surfaces of cellulase and pectase

果胶酶添加量0.6%，酶解温度60℃的条件下，纤维素酶添加量和酶解时间的响应面和等高线如图6所示。由图可知，当纤维素酶添加量不变时，酶解时间对原花青素得率的影响呈现先增加后降低的趋势。而当酶解时间不变，随着纤维素酶的增加，原花青素得率出现先增加后降低的趋势，在中心点附近达到最高值。由方差分析可知两者交互作用显著。

在果胶酶添加量0.6%，酶解时间90min的条件下，纤维素酶添加量和酶解温度的响应面和等高线如图7所示。由图可知，当纤维素酶添加量不变时，酶解温度对原花青素得率的影响先增加而后降低。当酶解温度不变时，纤维素酶添加量对原花青素得率的影响与提取温度类似，且在中心点附近达到最高值。

在纤维素酶添加量0.4%，酶解温度65℃条件下，果胶酶添加量和酶解时间的响应面和等高线如图8所示。从图中可以看出，果胶酶添加量不变，随着液料比的增大，原花青素得率逐渐增大。在酶解时间不变时，随着果胶酶添加量增加，原花青素得率逐渐增加，后略微降低。由方差分析结果可知，两者的交互作用显著。

图6 纤维素酶添加量和酶解时间的响应面Fig.6 Response surfaces of cellulase and enzyme time

图7 纤维素添加量和酶解温度的响应面Fig.7 Response surfaces of cellulase and enyzme temperature

图8 果胶酶添加量和酶解时间的响应面Fig.8 Response surfaces of pectase and enzyme time

在纤维素酶添加量0.4%，酶解时间90min的条件下，果胶酶添加量和酶解温度的响应面和等高线如图9所示。由图可知，果胶酶添加量一定时，随着酶解温度的增大，原花青素的得率逐渐增加，而后略微降低，在中心点附近原花青素得率达到最高。酶解温度不变时，随着果胶酶的增加，原花青素得率逐渐增大。由方差分析可知两者的交互作用显著。

纤维素酶添加量0.4%，果胶酶添加量0.6%的条件下，酶解时间和酶解温度的响应面和等高线如图10所示。由图可知，当酶解时间一定时，随着酶解温度的增加，原花青素得率先增加后降低，在中心点附近达到最大值。当酶解温度处于一定水平时，随着酶解时间的延长，原花青素得率也呈先增大后下降的趋势。

图9 果胶酶添加量和酶解温度的响应面Fig.9 Response surfaces of pectase and enzyme temperature

图10 酶解时间和酶解温度的响应面Fig.10 Response surfaces of enzyme time and enzyme temperature

利用已建立的数学模型在实验范围内优化出最优条件为:纤维素酶添加量0.4%，果胶酶添加量0.69%，酶解时间92min，酶解温度65℃。在此条件下，葛花原花青素的得率为5.02mg/g。

2.3 葛花原花青素的纯化

为验证模型的可靠性，在此条件下进行验证实验，葛花原花青素的平均得率为5.05mg/g。与理论预测值相比，其相对误差约为0.60%，说明数学模型可靠。

2.4 葛花原花青素的体外抗氧化能力

2.4.1 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一种相对稳定的自由基，是评价抗氧化剂抗氧化能力的常用方法［17］。葛花原花青素对DPPH自由基的清除能力见图11。

图11 葛花原花青素的DPPH自由基清除能力Fig.11 DPPH radical scavenging activity of PC from puaearia

由图11可知，原花青素对DPPH自由基的清除能力呈一定的量效关系，清除率随着原花青素的浓度增加而逐渐增大。当原花青素浓度达到0.2mg/mL时，清除率在90%以上。以VC为对照，两者的IC50值分别为0.087、0.105mg/mL，说明葛花原花青素呈现出较好的抗氧化活性。

2.4.2 羟自由基清除能力 羟自由基是活性较高的自由基，它与衰老、癌症及多种疾病的发生有关［18］。清除羟自由基可能是防御一些疾病的有效手段。葛花原花青素对羟自由基的清除能力如图12所示。

图12 葛花原花青素的羟自由基清除能力Fig.12 Hydroxyl free radical scavenging activity of PC from puaearia and VCas positive control

由图12可知，原花青素对羟自由基的清除能力呈一定的量效关系，清除率随原花青素浓度的增加逐渐增大，在1.5mg/mL的浓度时即达到80%以上。以VC为对照，两者的IC50值分别为0.767、1.310 mg/mL。

2.4.3 超氧阴离子自由基清除能力 超氧阴离子自由基是活性氧之一。大量的超氧阴离子自由基会使细胞中超氧化物歧化酶钝化［19］，从而使细胞受到毒害甚至死亡。超氧阴离子自由基清除率是常用的抗氧化活性指标。

由图13可知，葛花原花青素是具有较高的超氧阴离子自由基清除能力，在0.6mg/mL的浓度时清除能力即达到90%以上。与VC相比，原花青素呈现较高的超氧阴离子自由基清除能力。两者的IC50值分别为0.303mg/mL、0.371mg/mL。

图13 葛花原花青素的超氧阴离子自由基清除能力Fig.13 Superoxide anion free radical scavenging activity of PC from puaearia and VCas positive control

3 结论

通过单因素实验和Box－Behnken实验设计优化，研究纤维素酶添加量、果胶酶添加量、酶解时间和酶解温度对葛花原花青素得率的影响。经优化实验得到的最佳提取工艺为:纤维素酶添加量0.40%，果胶酶添加量0.69%，酶解时间92min，酶解温度65℃。在此条件下，葛花原花青素的得率为5.02mg/g。所得原花青素具有良好的抗氧化活性，其DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率的IC50值分别为0.087，0.767，0.303mg/mL。

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