罗汉松果内生真菌次级代谢产物研究

杨春贵，李 琳，魏佩瑶，罗都强

(河北大学药物化学与分子诊断教育部重点实验室，河北 保定 071002)

目前，相关研究人员已经从罗汉松属植物体内分离出大量内生真菌，某些成分还具有抑癌活性、抗菌活性等[1]。罗汉松果内生真菌Pestalotiopsis zoneata为拟盘多毛孢属真菌，关于其次级代谢产物的研究还比较少，因此本实验对罗汉松果内生真菌的次级代谢产物进行了化学成分研究，为其进一步研究提供科研依据。

1 仪器与材料

BUCHI R-210型旋转蒸发仪，Bruker AVANCE III-600核磁共振谱仪，Waters高效液相色谱仪，ZF7三用紫外分析仪，Apex-Ultra7.0T高分辨傅里叶变换离子回旋质谱仪，吹风机，制备薄层色谱硅胶GF254，DL-1电烤炉，电子天平，柱层析色谱硅胶，Sephadex LH-20凝胶等。菌株:罗汉松果内生真菌Pestalotiopsis zoneata，由河北大学药物化学与分子诊断教育部重点实验室保存提供。

2 发酵与提取分离

2.1 种子液制备及扩大培养发酵

将罗汉松果内生真菌P.zoneata菌种接种于cPDA种子培养基(6L)中，摇床150r/min，26℃下培养8天;制作大米培养基20L(500mL三角瓶)高温高压灭菌后，将10%种子液转接到培养基内，26℃下持续发酵35天。

2.2 提取及分离纯化

丙酮萃取菌体得浸膏33g，拌硅胶上柱子，将石油醚/乙酸乙酯按比例梯度:100/0，95/5，90/10，80/20，50/50 洗脱得到Y1-Y5五个馏分。Y2经硅胶柱两次层析，再经Sephadex LH-20(CH3OH)凝胶分离得化合物3(15mg)和化合物5(17mg);Y4经硅胶柱层析，再重结晶得化合物4(20mg);Y5经硅胶柱层析，再上凝胶(CH3OH)分离及制备薄层(Pre-TLC)，得到化合物1(8mg)和化合物2(17mg)。

3 结构鉴定

化合物1:4-羟基-4-甲基四氢-2H-吡喃-2-酮，分子式为C6H10O3，M=130，无色晶体。1H-NMR(600MHz，CDCl3)δH:1.38(3H，s)，2.65(1H，d)，2.67(1H，d)，4.34(1H，m)，4.59(1H，m).13C-NMR(150MHz，CDCl3)δC:171.17(s，C-1)，44.60(t，C-2)，67.97(s，C-3)，35.74(t，C-4)，66.23 C-5)，29.55(q，C-6)。以上数据与文献[2]一致。

化合物2:7-羟基-5-甲氧基-4，6-二甲基-7-O-a-L-鼠李糖苯酞，分子式为 C17H22O8，M=354，无色油状。1H-NMR(600MHz，CD3OD):δH，1.24(3H，d)，2.21(3H，s)，2.28(3H，s)，3.52(1H，t)，3.80(3H，s)，3.91(1H，dd)，4.02(1H，m)，4.50(1H，m)，5.24(2H，d)，5.53(1H，d)。13CNMR(150MHz，CD3OD)δC:169.9(s，C-1)，68.4(t，C-2)，147.1(s，C-3)，120.8(s，C-4)，153.5(s，C-5)，125.2(s，C-6)，163.0(s，C-7)，111.7(s，C-8)，105.0(d，C-9)，70.8(d，C-10)，70.6(d，C-11)，70.9(d，C-12)，72.0(d，C-13)，10.0(q，C-14)，59.5(q，C-15)，9.2(q，C-16)，16.6(q，C-17)。以上数据与文献[3]一致。

化合物3:4-羟基苯甲酸，分子式为C7H6O3，M=138，无色晶体。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δH:7.89(2H，d)，6.83(2H， d).13C-NMR(150MHz， CD3OD) δC:121.4(s，C-1)，131.6(d，C-2)，114，6(d，C-3)，161.9(s，C-4)，114.6(d，C-5)，131.6(d，C-6)，168.7(s，C-7)。以上数据与文献[4]一致。

化合物4:4-羟基苯乙酸，分子式为C8H8O3，M=152，无色晶体。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δH:7.10(2H，d)，6.74(2H，d)，3.50(2H，s)。13C-NMR(150MHz，CD3OD)δC:125.4(s，C-1)，129.9(d，C-2)，114.8(d，C-3)，155.9(s，C-4)，114.8(d，C-5)，129.9(d，C-6)，39.7(t，C-7)，174.9(s，C-8)。以上数据与文献[5]一致。

化合物5:4-羟基苯乙醇，分子式为C8H10O2，M=138，无色晶体。1H-NMR(600MHz，CD3OD)δH:7.05(2H，d)，6.72(2H，d)，3.74(2H，t)，2.73(2H，t)。13C-NMR(150MHz，CD3OD)δC:129.5(s，C-1)，129.5(d，C-2)，114.7(d，C-3)，155.3(s，C-4)，114.7(d，C-5)，129.5(d，C-6)，63.1(t，C-7)，38.0(t，C-8)。以上数据与文献[6]一致。

4 结语

本文通过高效液相色谱制备法、凝胶色谱分离法、正反向硅胶柱色谱分离法以及制备薄层层析色谱分离法对罗汉松果内生真菌的次级代谢产物进行了分离纯化，并采用NMR和MS等现代波谱分析法对其进行了结构鉴定，从中首次分离鉴定出了5个化合物。该方法准确可靠，为罗汉果次级代谢产物的研究提供了科学依据。

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