14-3-3蛋白家族新机制和新功能研究

赖利平，潘伟男，邓水秀

(湖南食品药品职业学院，湖南 长沙 410208)

14-3-3蛋白家族是一组在生物有机体和组织中广泛表达的、高度保守的、分子量约为25～30KD的酸性蛋白质。根据高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)中5个亚型各自的洗脱位置将哺乳动物脑中14-3-3蛋白的主要亚型命名为α～η，其中α和δ分别是β和ζ的磷酸化形式，另外两个亚型τ(也称为θ)和σ分别在T细胞和上皮细胞中表达，τ亚型也在脑等其他组织中广泛表达，7种亚型均存在于所有真核细胞中。14-3-3作为一个二聚体蛋白家族，调控蛋白质之间的相互作用，广泛参与细胞信号转导、周期进程、生长增殖、分化凋亡和扩展迁移。本文就14-3-3蛋白功能、机制的研究进展予以综述。

1 14-3-3在细胞生长、增殖和分化中的作用

14-3-3通过不同的机制来调控细胞生长、增殖和分化。14-3-3在Raf-1/ERK/MAPK(细胞外信号调节激酶，即促丝裂原激活蛋白)途径中是通过与Raf-1的相互作用来调控细胞生长的。MAPK信号的级联放大作用控制着细胞的生长、增殖和分化，包括多种底物和限速步骤。生长因子、激素和丝裂原能促使细胞外信号调节激酶ERK1和ERK2活化，MEK1和MEK2促丝裂原激活蛋白激酶激酶 MAPKK(或称ERK活化激酶)活化ERK1/ERK2，而Raf-1能活化MEK1/MEK2。Ras作为Raf-1活性的刺激因子，在局部发挥激活的作用，对质膜进行恢复补充。MEK1/MEK2活化后，其将激活MAPK。在此级联放大的作用下，MEK1/2和MAPK激活潜在的转录因子并改变其基因表达方式[1]。14-3-3蛋白调控Raf-1的功能已经明确，但其调控机制非常复杂，仍在继续深入地研究探讨中。Raf的所有亚型中均含有14-3-3蛋白的两个结合位点，其中一个结合位点是显性位点或称为“管理者”位点[2]。在未活化的细胞中，显性位点是磷酸化的，而另一位点是非磷酸化的。Raf-1并不能促使稳定的Raf/14-3-3相互作用，因此，每个14-3-3二聚体仅通过其中一个结合位点(模序)与靶蛋白结合。当Raf-1的另一结合位点被磷酸化后，在高度局限性的浓缩作用的诱导下，其能与靶蛋白接近并快速结合。研究发现第一个结合位点(模序)定位于Ser 621，即激活Raf-1的重要调节区域，第二个结合模序定位于Ser 259，即抑制Raf-1的重要催化结构域[3]。在未活化的细胞中，Raf-1的Ser 259是未磷酸化的，14-3-3不能结合Raf-1的N端，使Raf-1发挥对质膜的激活作用。当两个结合位点均被磷酸化后，14-3-3结合Raf-1的N端并引起其构象变化，然而在此过程中14-3-3自身仅有轻微的构象变化。研究结果显示，14-3-3分离Raf-1从而阻断其对质膜的恢复作用，并抑制Ras/MAPK途径[4]。研究发现，apelin-13通过14-3-3/Raf-1复合物-ERK 1/2信号转导通路促进大鼠血管平滑肌细胞增殖[5]。

14-3-3调控细胞生长和增殖的另一个机制是促丝裂原激活蛋白激酶-1(BMK1)。BMK1是MAPK家族的另一重要成员，其能促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，但BMK1的调控机制尚不十分清楚。MEK5是一个逆向作用的激酶，可促使BMK1磷酸化而激活。BMK1活化后使转录因子MEF2C磷酸化并被激活，14-3-3β与BMK1调控有关。有研究证实BMK1 C端的Ser 486磷酸化后才能与14-3-3β结合，而且14-3-3β与BMK1结合后可抑制BMK1的磷酸化并阻断后续的 MEF2C激活作用[6]。另有研究证实，通过BMK1(Ser 486，即定位在BMK1-MEF2C的相互作用位点区域)和14-3-3的相互作用，14-3-3可能竞争性地抑制BMK1与MEF2C结合。因此，14-3-3可通过激活BMK1转录因子底物来抑制BMK1。近期研究证实，14-3-3结合p27调控细胞增殖，p27是一个周期依赖性蛋白激酶抑制因子，迁移至核内后抑制周期依赖性蛋白激酶的活性并阻断细胞周期的进程。因为周期依赖性蛋白激酶是核蛋白，p27定位在细胞核内对其抑制周期依赖性蛋白激酶的活性具有重要意义。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt途径调控细胞增殖、生存及活性，但过度激活有致癌作用。Akt磷酸化p27定位于Ser 10、Thr 157和Thr 198，p27的Thr 157磷酸化与14-3-3密切相关。在胞浆中14-3-3与p27分离，故能抑制p27的核内功能[7]，最终激活细胞周期蛋白CDK复合物和细胞周期进程。

2 14-3-3在细胞周期调控和细胞凋亡中的作用

14-3-3在细胞周期调控中发挥了较重要的作用。14-3-3与其靶蛋白结合后通过不同的机制影响细胞周期进程，也有可能通过影响蛋白质定位或改变酶活性来影响细胞周期进程。Cdc25C是Cdc25双重蛋白磷酸酶家族的成员之一，此家族包括 Cdc25A、Cdc25B和 Cdc25C。Cdc25B和Cdc25C已经被证实与CDCK1/cyclin B1复合物(此复合物促使细胞周期从G2期向M期过渡)的激活有关。Cdc25C激活周期依赖性蛋白激酶CDC2，而CDC2经有丝分裂促进细胞生长。Cdc25B的过度表达比Cdc25C更能有效诱发过早的有丝分裂并可导致有丝分裂突变。在分裂间期，14-3-3ε、14-3-3γ与Cdc25C结合可能是通过CDC2抑制过早激活的作用实现的，使得胞浆中的Cdc25C隔离并失活，而Cdc25C通过TAK1激酶和其他未知激酶在Ser 216磷酸化后可与14-3-3ε/γ 结合[8]。此外，CDC2抑制 CDC2激活剂的作用可确保其在有丝分裂开始阶段就具有活性。当所谓的“检查点激酶”CH1K活化时，以相似的机制在DNA损伤后发挥作用。CH1K磷酸化Cdc 25C后，使其与14-3-3蛋白结合，Cdc25C在胞浆中分离开来并使细胞周期停滞在G2期。与之相反，14-3-3σ等另外5种亚型不能与Cdc25C直接结合[8]，14-3-3σ对Cdc25C的间接影响是通过Cdc25C诱导的抑制染色质过早凝聚来完成的，而14-3-3β与14-3-3ε通过相同的调控机制也能抑制Cdc25B。14-3-3还可直接通过影响wee-1酶活性来调控细胞周期。Wee-1是一种酪氨酸激酶，在分裂间期经磷酸化而被激活，其在Ser 642位点磷酸化后与14-3-3蛋白结合并能增强其活性，活化的Wee-1抑制CDC2磷酸化并阻断细胞周期进程[9]。

14-3-3通过与两种凋亡前体蛋白Bax和BAD相互作用来调控细胞凋亡。正常情况下，Bax在无活性状态时位于细胞质中，DNA损伤后，未与14-3-3σ结合的Bax位于中心体周围的线粒体中，并促使细胞快速进入凋亡过程。然而当14-3-3σ存在时，14-3-3σ通过非依赖性磷酸化途径与Bax相互作用，两者结合后Bax在胞浆中处于无活性状态，阻止细胞进入凋亡过程，最近报道了14-3-3θ与Bax相互作用也有此类似效应[10]。此外，14-3-3通过调节BAD调控细胞凋亡，BAD可以抑制Bcl2和Bclx的抗凋亡作用。在Akt、PKA和核糖体S6激酶-1磷酸化BAD后，BAD可与14-3-3结合。两者结合后，14-3-3诱导BAD构象变化，使BAD从Bcl2或者Bclx中分离出来，依次阻断BAD的凋亡前体效应。因此，14-3-3蛋白在阻碍和抑制细胞凋亡中发挥了积极作用，可在细胞损伤至凋亡的一段时间内完成DNA的修复。

3 14-3-3在细胞扩展和迁移中的作用

14-3-3通过整联蛋白调节机制在调控细胞扩展和迁移中发挥作用。整联蛋白是细胞表面的糖蛋白家族，其将细胞外基质与肌动蛋白细胞支架相连接。通过跨膜信号转导的调节，整联蛋白可以调控细胞扩展、迁移和存活。14-3-3β与β-1整联蛋白的胞质尾区相互作用，而14-3-3β的过度表达可刺激细胞扩展和迁移。大多数蛋白质是通过依赖性磷酸化或非依赖性磷酸化途径与14-3-3相互作用的，然而与其他蛋白质不同的是，在依赖性磷酸化或非依赖性磷酸化途径中，β-1整联蛋白胞质尾区不与14-3-3的基序结合，β-1整联蛋白与14-3-3β通过另一种机制结合。最新研究显示，14-3-3β通过一个新的结合位点与β-1整联蛋白相互作用，但此作用需要位于14-3-3β兼性凹槽外的helix C Ser60残基的参与[11]。Ser60磷酸化后可能会阻断14-3-3β与 β-1整联蛋白胞浆区的相互作用，促进细胞扩展和迁移。此外14-3-3β可能还通过与Raf-1、p130cas(细胞扩展中有关的微量蛋白)或其他与细胞迁移有关的信号途径相互作用来促进细胞扩展和迁移。

14-3-3影响细胞扩展和迁移的另一个机制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)途径。兴奋性细胞内钙触发剂多重信号途径包括CaMK级联及其下游靶点CaMKⅠ、CaMKⅣ和蛋白激酶B(PKB)。CaMKⅠ位于细胞质中，起到调控mRNA翻译、细胞支架构建和轴突生长活力的作用。CaMKⅣ位于核内，起调控基因转录的作用。此外，在兴奋性胞内Ca2+存在的情况下，CaMKⅠ和CaMKⅣ上的磷酸化位点被CaMK激酶(CaMKK)磷酸化后得以激活。最新研究显示，CaMKK中PKA介导的磷酸化存在三个调节位点，分别为Ser74、Ser108和Ser458，其中Ser108和Ser458磷酸化可使CaMKK失活，Ser74磷酸化后可使CaMKK与14-3-3结合从而抑制CaMKK。此外，CaMKK与14-3-3结合可以阻断Thr108脱磷酸化作用，使CaMKK处于无活性状态[12]。

4 结语

尽管在1968年就已经发现了14-3-3蛋白家族，但直到10多年前才有研究发现其特殊作用。最新研究显示，14-3-3在细胞周期调控、分化、凋亡、扩展、迁移等方面作用显著，预测未来的深入研究可开启14-3-3与细胞功能调控复杂关系的密钥。

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