去整合素Echistatin抑制糖尿病兔远期后发性白内障△

钱光霞 谭少健 梁皓 陈迎迎

后发性白内障(posterior capsular opacification，PCO)是白内障术后最常见的并发症，也是导致术后视力再次下降的主要原因。糖尿病患者PCO的发生率明显高于正常血糖患者，且随着时间的推移而增加［1］。已有研究证明去整合素(Echistatin，Ecs)可明显抑制体外晶状体上皮细胞(lens epithelial cell，LEC)的黏附、迁移和增殖［2］。因此，本实验旨在观察不同浓度Ecs在糖尿病兔眼晶状体摘出术后对PCO LEC增殖的抑制作用及适宜浓度，为Ecs治疗PCO提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新西兰大白兔16只(购自广西医科大学实验动物中心)，雌雄不限，体质量2.4～2.8 kg，眼部检查无异常。

1.1.2 仪器与试剂 Ecs(美国Sigma公司，以高压灭菌蒸馏水新鲜配制成实验所需浓度);四氧嘧啶(美国Sigma公司);长效胰岛素注射液(甘精胰岛素注射液，德国);小鼠抗兔增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)单克隆抗体(武汉博士德);SABC(即用型羊抗小鼠IgG)试剂盒及DAB显色试剂盒(武汉博士德);TUNEL细胞凋亡试剂盒(德国Roche公司);血糖分析仪、血糖试纸条(美国强生公司);手术显微镜、眼科显微手术器械、裂隙灯显微镜(苏州医疗器械厂);病理图像分析系统(德国莱卡公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立及分组 建立糖尿病兔动物模型［3］，将新西兰大白兔用四氧嘧啶按90 mg· kg－1建立糖尿病兔模型，当血糖持续2周高于12 mmol·L－1者为建模成功。对于血糖浓度高于16 mmol·L－1者，根据血糖值给予皮下注射长效胰岛素，使其血糖控制在12～16 mmol·L－1。16只16眼(右眼)糖尿病兔按随机数字表法分为对照组(A组)和3组实验组(B组、C组、D组)，每组4只(4眼)。

1.2.2 药物处理 16只建模成功的糖尿病兔，每只兔右眼由同一术者行透明晶状体囊外摘出术。A组术毕前房注入蒸馏水0.2 mL，B组、C组、D组分别注入 5.0×10－3μg·L－1、7.5×10－3μg·L－1、10.0×10－3μg·L－1Ecs溶液。术后用庆大霉素地塞米松眼液和阿托品眼液滴术眼7～10 d，每天4次。夜间涂四环素可的松眼膏，直至角膜水肿、前房渗出消失。

1.2.3 临床观察 术后1 d、3 d、7 d、10 d、6周分别用裂隙灯显微镜检查角膜、前房和PCO发生情况。对PCO发生情况按Odrich PCO分级［4］:0级:透明; 1级:轻度混浊，能看清眼底或混浊面积小于1/2后囊膜面积;2级:中度混浊，能模糊看见眼底或混浊面积大于1/2后囊膜面积;3级:完全混浊，不能看见眼底。

1.2.4 组织病理学检查 术后6周［5］用空气栓塞法处死各组兔，摘取术眼用40 g·L－1多聚甲醛固定6～7 d，经梯度乙醇脱水，二甲苯清洗，石蜡包埋，切片。HE染色:切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗，苏木素染色5 min，自来水冲洗，盐酸酒精分化30 s，自来水浸泡15 min，置伊红液2 min，常规脱水，透明，封片。免疫组织化学SABC法:二甲苯脱蜡，梯度酒精至水，体积分数30%H2O2室温封闭10 min;抗原修复，在0.01 mol·L－1枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)中修复10 min;滴加体积分数5%BSA封闭液封闭30 min，PCNA一抗4℃过夜;山羊抗小鼠IgG 50 μL，37℃孵育30 min;SABC复合物37℃孵育20 min。每步骤间隔均用0.01 mol·L－1PBS (pH=7.2～7.6)冲洗。DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，烘干，封片。结果判定:PCNA阳性表达为细胞核呈棕黄色。计算阳性细胞平均光密度值(average optical density，AOD)=总OD值/总面积，普通光学显微镜下每张切片随机选取6个高倍视野，求均数和标准差。

1.2.5 TUNEL法检测角膜内皮细胞、视网膜细胞凋亡 术后6周糖尿病兔术眼取材，常规二甲苯脱蜡;梯度酒精至水，体积分数3%H2O2室温封闭10 min;抗原修复，在0.01 mol·L－1枸橼酸盐缓冲液(pH=6.0)中修复10 min;TUNEL反应液(TdT反应液+标记液)50 μL湿盒37℃孵育60 min;转化剂-POD混合液50 μL湿盒37℃孵育30 min;DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，烘干，封片。普通光学显微镜下随机选取6个高倍视野(×400)，凋亡细胞呈棕黄色，计算角膜内皮凋亡细胞、视网膜神经节及内核层凋亡细胞的AOD值，AOD=总OD值/总面积。

2 结果

2.1 术后观察情况 A组、B组、C组及D组术后均出现不同程度的角膜水肿及前房渗出，4组角膜水肿均于术后3～5 d基本恢复正常;A组与B组术后前房渗出较少，于术后3～5 d基本消失，C组、D组前房渗出于术后6～7 d恢复正常。

2.2 晶状体PCO情况 各组糖尿病兔眼晶状体囊外摘出术后6周，可见随着药物浓度的增加，PCO程度减轻，各组间PCO分级差异有统计学意义(χ2= 11.134，P=0.011，见表1)，故可认为晶状体PCO级别与前房注射Ecs浓度有关。

表1 术后6周时各组PCO分级情况Table 1 PCO grading in each group at postoperative 6 weeks

2.3 HE染色情况 术后6周从形态学上观察可见各组角膜内皮细胞均排列整齐、未见水肿，视网膜内界膜及各层组织结构完整(图1)，未见药物引起明显组织损伤反应。

2.4 免疫组织化学法检测后囊膜PCNA表达 术后6周免疫组织化学染色结果显示(图2)，A组后囊膜可见大量PCNA阳性表达，B组也可见较多PCNA阳性表达，C组及D组可见少量PCNA阳性表达，尤其是D组较少。术后6周，各组间差异有统计学意义(F=5.638，P=0.012);B组与A组PCNA阳性表达差异无统计学意义(P＞0.05)，余组间两两比较差异均有统计学意义(均为P＜0.05，见表2)。

Figure 1 Pathologic graph at postoperative 6 weeks(HE，×400;1:Cornea;2:Retina).A:Control group;B:Group D 术后6周兔眼病理图片(HE ×400;1:角膜;2:视网膜)。A:对照组;D:D组

Figure 2 Expression of PCDA in LEC at posterior capsule in each group(SP，×400)，LEC nucleus was positive stained with brown-yellow.A-D: Group A to group D 各组后囊膜上LEC中PCNA的表达(SP，×400)，LEC细胞核阳性反应呈棕黄色。A、B、C、D分别为A组、B组、C组、D组

表2 术后各组后囊膜LEC PCNA的表达结果Table 2 PCNA expression in LEC at posterior capsule in each group (s)

表2 术后各组后囊膜LEC PCNA的表达结果Table 2 PCNA expression in LEC at posterior capsule in each group (s)

Note:Compared with group A，*P＞0.05，#P＜0.05

Group AOD P A 0.499±0.043 －B 0.484±0.055 0.581* C 0.422±0.012 0.016# D 0.340±0.031 0.000#

2.5 角膜内皮细胞及视网膜细胞的凋亡情况TUNEL法原位检测凋亡阳性细胞核呈棕褐色，非凋亡细胞核呈蓝色。各组间角膜内皮细胞和视网膜的神经节细胞层及内核层细胞凋亡情况比较差异均无统计学意义(均为P＞0.05，见表3-表4)。

3 讨论

有研究表明，糖尿病患者行白内障手术治疗后PCO的发生率为10.0%～57.7%，且随时间的推移而逐渐增加［6］。本课题前期研究也证明:正常血糖兔眼术后2周为PCO形成最早期，3个月为PCO形成的最显著期［7］。糖尿病兔发生PCO的最早期为术后10 d，最显著期为术后6周［5］，PCO发生及发展最早及最显著时间均早于正常兔，说明高血糖可能是加重PCO形成的一个重要因素。

表3 各组视网膜神经节细胞层和内核层细胞的凋亡情况Table 3 Average optical density of retinal ganglion cells and inner nuclear layer cells apoptosis in each group (s)

表3 各组视网膜神经节细胞层和内核层细胞的凋亡情况Table 3 Average optical density of retinal ganglion cells and inner nuclear layer cells apoptosis in each group (s)

Note:Comparison among all groups，F=1.180，P=0.358;Compared with group A，*P＞0.05

Group AOD P A 0.241±0.018 －B 0.251±0.013 0.543* C 0.255±0.032 0.366* D 0.269±0.021 0.090*

表4 各组角膜内皮细胞的凋亡情况Table 4 Average optical density of corneal endothelial cells apoptosis in each group (s)

表4 各组角膜内皮细胞的凋亡情况Table 4 Average optical density of corneal endothelial cells apoptosis in each group (s)

Note:Comparison among all groups，F=1.851，P=0.192

Group AOD P A 0.296±0.040 －B 0.304±0.035 0.722 C 0.332±0.024 0.137 D 0.342±0.025 0.067

在PCO的发生及发展过程中，整合素起着重要作用。PCO主要是由于术后残留的LEC迁移、增殖并纤维化，导致晶状体PCO发生［8］。整合素广泛存在于各种细胞表面，包括LEC表面，也是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分的主要受体［9］。Ecs属于Disintergrin家族的一员，具有其家族相似的分子机制和作用特性［10］。体内外实验均表明［11-12］，使用与Ecs有相似结构的Salmosin和Kistrin干预后，与对照组相比，可明显抑制LEC的黏附、迁移和增殖，从而抑制PCO的发展，并且对角膜、虹膜及视网膜均无明显副作用。范鹏举等［13］研究发现 Ecs可抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖，促进其凋亡，抑制胶原分泌，减少ECM沉积。周星等［2］研究证明浓度为(5～20)×10－3μg·L－1Ecs对体外人LEC细胞株SRA01/04的生长具有抑制作用，呈明显的剂量依赖性及时间依赖性，但浓度为20×10－3μg·L－1时细胞完全失去正常形态，出现崩解坏死。同时本课题组前期研究了(5.0～15.0)×10－3μg·L－1Ecs对糖尿病兔早期(10 d)PCO的抑制作用，结果证明15.0×10－3μg·L－1Ecs对角膜内皮细胞及视网膜细胞具有明显的促凋亡作用，因此本实验研究了浓度为(5.0～10.0)×10－3μg·L－1Ecs对糖尿病兔PCO发生高峰期(6周)的抑制作用。

通过检测在不同浓度Ecs的干预下，糖尿病兔行晶状体囊外摘出术后后囊膜LEC中PCNA的表达，作为判断Ecs是否能抑制后囊膜LEC增殖的依据，从而选择Ecs在糖尿病兔PCO模型中的有效浓度。PCNA是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，在细胞周期G期的晚期开始增加，S期达到高峰，因此PCNA是细胞周期S期的特异性标记，故检测PCNA可以很好地评价细胞的增殖状态，可作为检测LEC增殖的敏感指标［14］。本研究结果显示: C组、D组均可明显抑制后囊膜LEC中PCNA表达，但后者抑制作用较强，说明Ecs对糖尿病兔后囊膜上LEC增殖具有明显抑制作用，而B组后囊膜LEC中PCNA表达与A组无明显差异。同时在裂隙灯下观察PCO分级同样证明D组Ecs对糖尿病兔PCO的形成抑制作用较明显。其发生机制可能为Ecs与LEC表面整合素受体结合而抑制了整合素与ECM结合，细胞增殖受到抑制，减少了LEC与后囊膜的黏附作用，使LEC增殖及移行能力进一步下降，凋亡增加，因而抑制了PCO的形成。由此说明，10.0× 10－3μg·L－1Ecs在糖尿病兔PCO模型中使用是有效的，但还需进一步探讨其安全性。

采用HE染色法观察各组角膜及视网膜的变化发现，B组、C组、D组与A组角膜和视网膜组织结构均无明显差异，未见组织结构有明显损伤。同时通过TUNEL法检测角膜内皮细胞及视网膜神经节细胞层及内核层细胞的凋亡时发现，B组、C组、D组对眼内相邻组织(角膜)及重要光感受结构(视网膜)均未造成损害，且细胞未发生明显凋亡，说明10.0×10－3μg·L－1Ecs在眼内使用是安全的。

总之，本研究证明10.0×10－3μg·L－1Ecs在PCO的形成中对LEC的增殖具有抑制作用，且对眼内相邻及重要组织无明显毒性作用，因此可以选用此浓度在眼内进行后续实验研究，但其在临床应用的可能性尚需进一步探讨。

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