羧甲基决明子多糖的制备及表征

柳梦思，牛春梅，李绍英

（河北科技大学材料科学与工程学院，河北石家庄 050018）

决明子主要指小决明或钝叶决明的干燥种子［1］，是国家卫生部颁布的药食同源植物。其具有降压、降脂、明目保肝、抑菌等广泛的医药作用，又可用于饮品、软糖、冰淇淋、保健啤酒、酸奶等［2］。决明子在中国分布广、来源易、价格低，且提取方便，拥有广阔的市场前景和经济效益［3］。

决明子多糖主要由甘露糖和半乳糖构成，由呋喃链接，半乳糖与甘露糖质量比为1∶5，其相对分子质量为21万左右［1］。决明子多糖具有水不溶物含量高、不能快速溶胀和水合、溶解速度慢，以及黏度不易控制、耐电解质、耐剪切性较弱、易被生物降解、难以长期保存、水溶液颜色较深等缺点［4］，限制了决明子多糖的进一步应用。因此，对决明子多糖进行化学改性，改善其水溶性及易生物降解性是非常必要的。

决明子的研究主要集中于其成分、药理、结构、提取工艺和食品应用等方面［5-6］，但对决明子多糖化学改性研究较少。李绍英等研究了阳离子决明子多糖的制备［7］，GUPTA等合成了氨基甲酰甲基化决明子多糖［8］，SHARMA等研制了氰乙基化决明子多糖，改善其水溶性及透明性，但工艺复杂，副反应较多［9］。目前，仅有少量几篇论文介绍决明子多糖的羧甲基化改性，取代度均小于0.23，且只研究了羧甲基决明子多糖合成工艺，对其溶液各项性能及结构分析研究甚少［6，10］。由王继芝等和孙志敏等研究表明，引入羧甲基基团能有效提高多糖的水溶性［11-12］。因此，本实验以决明子多糖（CTG）为原料，氯乙酸（MCA）为醚化剂，异丙醇水溶液为分散剂，制备了高取代度羧甲基决明子多糖，并对其黏度、透明性和稳定性进行了一系列测试，为改性决明子多糖的进一步应用提供理论依据。

1 实验部分

1.1 原料及仪器

1）试剂：决明子多糖原粉，河南商丘益源科技有限公司；氯乙酸，分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；NaOH和异丙醇，分析纯，天津市百世化工有限公司。

2）仪器：NDJ型旋转式黏度计，上海精密科学仪器有限公司；721型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Prestige-21型傅里叶变换红外光谱测试仪，日本岛津公司；日本JNM-AL300型核磁共振仪，日本电子株式会社；METZSCH STA 449C型热重分析仪，梅特勒-托利多公司。

1.2 实验方法

1.2.1 羧甲基决明子多糖的制备

将16.2 g决明子多糖粉和一定质量的75%（体积分数）异丙醇置于100 m L三口瓶中，加入氢氧化钠，在恒温条件下搅拌均匀，预处理30～75 min后，加入一定量的氯乙酸溶液，控温在50～60℃，反应2.5～3.5 h，过滤，所得滤饼用60%（体积分数）乙醇溶液进行洗涤。然后在50℃烘干至恒重。取出产品装入密封袋保存，称重，以便测试其性能时使用。

1.2.2 羧甲基取代度的测定

参照文献［13］羧甲基罗望子取代度的测定方法测定羧甲基决明子多糖的取代度。

1.2.3 溶液黏度的测定

将产品配置成一定浓度的水溶液，搅拌均匀，调p H值为7～8，静置24 h。参照文献［14］，测试其黏度，每组测试3次取平均值，作为黏度值。

1.2.4 透光率的测定

将产品配置成2%（质量分数）的溶液，搅拌均匀，调p H值为7～8，静置24 h。然后将溶液装入比色皿中，选择波长为524 nm，以蒸馏水做参照比（蒸馏水透光率为100%），每组试样测试3次，取其平均值作为透光率。

1.2.5 FTIR测试

用KBr压片法，采用Prestige-21型红外光谱仪对决明子原粉和羧甲基决明子多糖进行红外扫描，波长范围为400～4 000 cm-1。

1.2.613C-NMR图谱测试

将样品用无水乙醇萃取数次后进行真空烘干。以D2O为溶剂，用日本JNM-AL300型核磁共振仪测定决明子多糖及羧甲基决明子多糖的13C-NMR谱图。

1.2.7 TGA-DAT分析

用NETZSCH STA 449C型热分析仪对测试样品在N2氛围下进行TGA分析。其中测定温度范围为10～500℃，升温速度为10℃／min。

2 结果与讨论

2.1 FTIR分析

从表1中可看出，决明子原粉的特征吸收峰：3 425 cm-1处为O—H伸缩振动，2 924 cm-1处为C—H伸缩振动，1 151 cm-1处为C—O伸缩振动。羧甲基决明子多糖在1 621，1 416，1 325 cm-1处出现新的特征峰。1 621 cm-1特征峰是—COO—的非对称伸缩振动，1 416 cm-1和1 325 cm-1为—COO—的对称伸缩振动，表明羧甲基的存在。表明羧甲基已引入决明子多糖分子上，证明了决明子多糖羧甲基化的可行性。

表1 FTIR峰值表Tab.1 FTIR spectrum of CTG and CM-CTG

2.2 13 C-NMR分析

如图1所示，决明子多糖在61.1×10-6，72.3×10-6，102.6×10-6处分别为C-1，C-2，C-3的特征峰。羧甲基决明子多糖除以上3个特征峰外，在175.5×10-6处存在—COONa的特征峰。因此，决明子多糖分子上存在羧甲基钠基团，证明了羧甲基化反应的成功。

图1 羧甲基决明子多糖与决明子原粉的13 C-NMR谱图Fig.1 13 C-NMR spectra of CM-CTG and CTG

2.3 TGA-DAT分析

多糖的热失重数据将为样品的热稳定性提供重要数据。由图2可知，100℃之前样品的质量小幅度快速减少，说明水分和小分子挥发流失；决明子多糖在190～304℃快速降解，质量损失约为50%。温度继续升高，产品质量变化较小，主要为分解后得到的碳化物与灰分。羧甲基决明子多糖在190～283℃范围内发生降解，分解温度比原粉降低，因为改性过程使得决明子多糖分子发生一定程度的降解，使得产品耐热性稍有下降。且由于产品后期的洗涤过程使得羧甲基决明子多糖灰分降低，质量损失约为60%。

图2 决明子多糖原粉和羧甲基决明子多糖的热失重曲线Fig.2 TGA-DAT pattern of CTG and CM-CTG

2.4 氯乙酸用量对羧甲基化反应的影响

氯乙酸在反应中作为醚化剂，碱用量不变，与决明子多糖进行反应将羟基转变为羧甲基钠，从而对决明子多糖进行改性。氯乙酸与决明子多糖的物质的量比n（MCA）／n（CTG）对羧甲基决明子多糖取代度（以下简称DS）的影响如图3所示。

由图3可知，在一定范围内随着n（MCA）／n（CTG）的增大，产品取代度逐渐升高，且于物质的量比为1.6时，达到较大值0.60，此后随着n（MCA）／n（CTG）的继续增大，产品取代度逐渐降低。氯乙酸作为羧甲基化反应的醚化剂，随着n（MCA）／n（CTG）的增大，醚化剂浓度逐渐升高，有效加速羧甲基化反应的进行，醚化反应向生成物方向移动，使得产品取代度增大。当n（MCA）／n（CTG）继续增加至2.0时，取代度降至0.19，因为在反应过程中，当n（MCA）／n（CTG）超过一定值后，由于氯乙酸与氢氧化钠的中和反应，使得体系氢氧化钠浓度不断下降，决明子多糖溶胀程度减弱，反应物难以进入决明子多糖颗粒中进行反应；同时，体系碱性下降，不利于羧甲基化反应，若进一步增加氯乙酸用量，产品取代度也会随之下降。由此可知n（MCA）／n（CTG）较佳值为1.6∶1。

2.5 固液比

固液比在一定条件下直接影响决明子多糖的溶胀和反应物浓度，进而影响羧甲基化的反应程度。实验研究了羧甲基决明子多糖取代度随固液比的变化趋势，实验结果如图4所示。

图3 氯乙酸与决明子多糖的物质的量比对DS的影响Fig.3 Dependence of n（MCA）／n（CTG）on DS

图4 固液比对DS的影响Fig.4 Dependence ofthe ratio of solid to liquid on DS

由图4可知，碱化过程中，随着固液比的降低，NaOH浓度随之升高，碱化效果提高，醚化过程中氯乙酸钠浓度提高，产品取代度也不断提高。由图4得，提高固液比，副反应变化较小，但增大了决明子多糖与反应试剂的有效碰撞，使得正反应效率提高较大，有效增加了氯乙酸利用率，产品取代度随之增大。但当固液比小于1∶2.5时，由于分散剂过少，决明子多糖将无法完全分散，同时搅拌过于困难，产品羧甲基基团分布不均，所以固液比为1∶2.5时为较佳固液比。

2.6 碱化时间

碱化过程中，氢氧化钠与决明子多糖作用，多糖分子间氢键打开，促进颗粒溶胀，同时生成氧负离子钠，促进醚化反应的进行。实验研究了碱化时间对产品取代度的影响，结果见图5。

由图5可知，碱化时间越长，决明子多糖链间的氢键打开越多，颗粒溶胀程度越大，氯乙酸分子越易渗透到颗粒中，同时生成氧负离子钠越多，越有利于后期醚化反应的进行，产品取代度逐渐增大。当碱化时间超过60 min时，继续延长碱化时间，决明子多糖分子断键不断增多，从而生成较多小分子，洗涤过程中易流失，从而平均取代度稍有下降，说明60 min为较佳碱化时间。

2.7 碱化温度

由图6可知，碱化温度越高，决明子溶胀越好，使分子链更易与氢氧化钠接触，生成氧负离子钠越多，越有利于后期醚化反应的进行，提高取代度，但温度越高副反应越严重。40℃时取代度较高。碱化温度继续升高，副反应迅速增大，正反应增大较小，表现为取代度急剧下降；碱化温度由40℃升至55℃，正反应随温度变化较小，副反应不断增大，取代度逐渐减小；温度增加使得分子链断键严重，分子量较低的分子链在洗涤和提纯过程中损失较大，使取代度较小，且产品收率偏低。因此，40℃为较佳碱化温度。

图5 碱化时间对DS的影响Fig.5 Dependence of alkalization time on DS

图6 碱化温度对DS的影响Fig.6 Dependence of alkalization temperature on DS

2.8 醚化时间

由图7可知，反应时间过短，氯乙酸与决明子多糖醚化反应时间不足，羧甲基取代度较小，延长反应时间，羧甲基化反应越充分，分子链上羧甲基取代基越多，使产品溶解性提高，黏度和透光率增大；但超过3 h后分子链断键更严重，多糖分子链降解增加，副反应增多，小分子在后期洗涤过程中流失，使产品取代度降低，黏度也减小。因此3.0 h为较佳醚化时间。

2.9 醚化温度

由图8中可以看出，醚化温度对反应取代度影响很大。醚化温度在50℃到53℃之间，随着温度的升高，产品取代度随之增大，达到最高值0.64，此后温度继续升高，产品取代度不断降低。在一定温度范围内，醚化温度越高，越有利于决明子多糖颗粒的溶胀，使得氢氧化钠、氯乙酸和分散剂更易于渗透入颗粒中，增加了分子间的有效碰撞，同时温度升高增大了反应试剂的活性，羧甲基取代度不断增加。当温度高于53℃时，会促使决明子多糖的降解和反应试剂的分解，提高了副反应程度，降低羧甲基化反应效率，使得羧甲基取代度降低。因此确定较佳醚化温度为53℃。

图7 醚化时间对DS的影响Fig.7 Dependence of etherification time on DS

图8 醚化温度对DS的影响Fig.8 Dependence of etherification temperature on DS

2.10 耐电解质研究

分子结构中存在活性较高的羧甲基，以阴离子形式存在于离子化溶剂中，阳离子作为抗衡离子分布在高分子阴离子的周围，平衡部分阴离子静电场，减弱分子链间的相互排斥，从而使多糖分子链溶解分散更好，增大了溶液的黏度。

将样品配置1%（质量分数）的水溶液，在不加入任何盐溶液的情况下，测得其黏度为132 mPa·s，随着离子浓度与离子种类的变化溶液黏度的变化趋势如图9所示。

从图9中可以看出，溶液黏度均随着盐溶液质量分数的增加而增大。KCl的质量分数（下同）从1%到2%黏度有很大幅度的提高，但随着KCl浓度的增加，黏度虽然有所波动但趋于145 mPa·s左右，不再发生大的变化，说明2%的KCl溶液对样品的增稠效果比较明显。随着NaCl的质量分数的增加，黏度逐渐增加，但当NaCl的质量分数达到4%时，随着质量分数的增加，黏度趋于平缓不再变化，说明4%的NaCl溶液对样品的增稠效果比较明显。

随着CaCl2的质量分数增加，黏度明显上升，说明CaCl2的增稠效果随着质量分数的增加而增大。Ca2＋不同于Na＋和K＋，为二价阳离子，由于价键的键桥作用，分子间发生交联，高分子尺寸增加，分子间缠绕程度增大，因此加入Ca2＋的溶液黏度约是K＋和Na＋的2倍，增稠效果更好。

2.11 质量分数对黏度、透光率的影响

将样品分别配置质量分数1%，2%，3%，4%，5%的水溶液，测定溶液黏度与透光率随羧甲基决明子多糖质量分数增大的变化趋势，如图10所示。随着产品质量分数的增加，分子链间缔合程度不断增大，黏度呈对数增加，由于溶液浓度的不断提高，同时溶液中水不溶物含量逐渐增大，透光率逐渐减小，由94%降低至62%。

图9 电解质质量分数对黏度的影响Fig.9 Dependence of electrolyte on apparent viscosity

图10 不同质量分数下产品的黏度和透光率Fig.10 Dependence of concentration on transmittance and apparent viscosity

2.12 时间稳定性

将样品配置成溶液，搅拌均匀，静置，并开始计时，用旋转式黏度计测其黏度，记录所测得数据，研究溶液黏度的稳定性。由图11可知，在有氧条件下，决明子多糖溶液容易滋生微生物，且随着时间的增加微生物浓度不断增大，导致决明子多糖链发生降解且发生霉变。酸性条件下多糖链中醚键发生断键，从而使溶液黏度不断下降。因此，决明子原粉黏度持续下降，到第5天时黏度仅为初始黏度的43.7%。

决明子多糖进行羧甲基化改性后使其结构发生变化，支链增大，羧甲基基团与H＋结合，阻碍了微生物及H＋对多糖链的降解作用。由图11可知，羧甲基决明子多糖溶液在2 d内黏度基本不变，5 d后黏度为初始溶液的76.9%，羧甲基决明子多糖溶液相对于原粉溶液稳定性明显提高。

图11 溶液的稳定时间性Fig.11 Time stability of CM-CTG solution

3 结 论

以氯乙酸为醚化剂，氢氧化钠为催化剂，异丙醇水溶液为分散剂，合成羧甲基决明子多糖。当氯乙酸与决明子多糖物质的量比为1.6∶1，固液比为1∶2.5，碱化时间为60 min，碱化温度为40℃，醚化时间为3.0 h，醚化温度为53℃时，产品羧甲基取代度为0.64，羧甲基利用率为79.5%，2%溶液黏度为270 mPa·s，透光率为93.8%。羧甲基决明子多糖溶液黏度2 d内基本不变，5 d后为初始溶液的76.9%，相对于原粉溶液稳定性明显提高，且在电解质存在条件下溶液黏度提高了25%～35%，可见耐电解质性良好。由TGA分析的，羧甲基决明子多糖热分解温度降低。FTIR和13C-NMR分析证明了羧甲基基团的存在，证明了羧甲基化反应的可行性。

／References：

［1］ 章晋武.决明子多糖的结构及其对仔猪生长、免疫和肠道微生态的影响研究［D］.南昌：南昌大学，2005.ZHANG Jinwu.Studies on the Structure of Polysaccharide from Cassiae Seeds and it＇s Influence on the Growth，Immunity and Intestinal Microflora of Piglets［D］.Nanchang：Nanchang University，2005.

［2］ 郝延军，桑育黎，赵余庆.决明子的研究进展［J］.中草药，2001，32（9）：858-859.HAO Yanjun，SANG Yuli，ZHAO Yuqing.Progress on cassia toragum［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，2001，32（9）：858-859.

［3］ 侯长军，张平平，霍丹群.决明子的应用研究进展［J］.海峡药学，2007，19（7）：7-9.HOU Changjun，ZHANG Pingping，HUO Danqun.Advance in studies on the application of Semen Cassiae［J］.Strait Pharmaceutical Journal，2007，19（7）：7-9.

［4］ GUPTA S，SHARMA P，SONI P L.Carboxymethylation of Cassia occidentalis seed gum［J］.Journal of Applied Polymer Science，2004，94（4）：1606-1611.

［5］ 刘训红，陶春洪，储 益.决明子及其炮制品中营养成分的分析［J］.中国中药杂志，1993，18（5）：12-15.LIU Xunhong，TAO Chunhong，CHU Yi.Analysis of nutritious constituents from Semen Cassia［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，1993，18（5）：12-15.

［6］ 郭晓强，颜 军，邬晓勇，等.决明子水溶性多糖的纯化及抗氧化活性研究［J］.食品科学，2007，28（8）：205-208.GUO Xiaoqiang，YAN Jun，WU Xiaoyong，et al.Study on purification and antioxidation of water-soluble polysaccharide isolated from Semen Cassia［J］.Food Science，2007，28（8）：205-208.

［7］ LI Shaoying，NIU Chunmei，ZHONG Huayu.Preparation and characterization of cationic Cassia tora gum［J］.Advanced Materials Research，2013，2606（781）：526-530.

［8］ GUPTA S，SHARMA P，SONI P L.Chemical modification of Cassia occidentalis seed gum：Carbamoylethylation［J］.Carbohydrate Polymers，2005，59（4）：501-506.

［9］ SHARMA B R，KUMAR V，SONI P L.Ceric ammonium nitrate-initiated graft copolymerization of acrylamide onto Cassia tora gum ［J］.Journal of Applied Polymer Science，2002，86（13）：3250-3255.

［10］ SHARMA B R，KUMAR V，SONI P L.Carbamoylethylation of Cassia tora gum［J］.Carbohydrate Polymers，2003，54（2）：143-147.

［11］ 王继芝，王未肖，高磊红，等.羧甲基壳聚糖对牛奶葡萄的保鲜效果研究［J］.河北科技大学学报，2007，28（4）：306-309.WANG Jizhi，WANG Weixiao，GAO Leihong，et al.Study of keeping milk grape fresh by using carboxymethyl chitosan in storage［J］.Journal of Hebei University of Science and Technology，2007，28（4）：306-309.

［12］ 孙智敏，王秀霞，安 静.羧甲基壳聚糖-Cu2＋配合物催化分解 H2O2的研究［J］.河北科技大学学报，2007，28（4）：302-305.SUN Zhimin，WANG Xiuxia，AN Jing.Study on the catalytic capability of carboxymethyl CMC-Cu2＋complex for decomposition of H2O2［J］.Journal of Hebei University of Science and Technology，2007，28（4）：302-305.

［13］ 兰 舫，牛春梅，李绍英.交联羧甲基罗望子胶对Cd2＋的吸附研究［J］.河北科技大学学报，2014，35（1）：29-33.LAN Fang，NIU Chunmei，LI Shaoying.Adsorption research of Cd2＋by crosslinked carboxymethyl tamarind［J］.Journal of Hebei University of Science and Technology，2014，35（1）：29-33.

［14］ 钟华宇，牛春梅，李绍英.沙蒿子多糖的阳离子化改性研究［J］.河北科技大学学报，2013，34（1）：30-35.ZHONG Huayu，NIU Chunmei，LI Shaoying.Cationization of artemisia seed polysaccharide［J］.Journal of Hebei University of Science and Technology，2013，34（1）：30-35.