奶牛前三把奶中优势病原菌的分离与药敏分析

杨树鑫，杜 军，朱娇玲

（1.宁夏吴忠市利通区动物卫生监督所，宁夏 吴忠751100；2.宁夏大学生命科学学院，宁夏 银川750021）

奶牛乳腺炎是奶牛养殖业中常见病之一，该病根据病原微生物的传播特点分为两类：第一类是接触传染性病原微生物，包括链球菌、金黄色葡萄球菌和支原体，这些病原菌殖于乳腺并通过挤奶工或挤奶机传播；第二类为环境性病原体，主要包括革兰阴性菌、凝固酶阴性葡萄球菌、环境链球菌、酵母等，此类病原菌主要由于奶牛乳房容易沾有大量细菌，这些细菌极易进入乳导管，在此生长繁殖[1-2]。目前对乳腺炎的研究重点主要集中于对患病奶牛病原菌的药敏分析、病理特点[3]、炎症因子、血清型和毒力因子[4]等的方面，极少有对挤奶和实验前弃掉的前3把奶中的病原菌进行规范化的研究，而奶牛前3把奶中含有大量的细菌种类，这些细菌严重影响着鲜奶的品质、幼畜的健康成长以及患病奶牛中病原菌的检测和研究。因此本实验对正常产奶奶牛前3把乳样进行病原菌的分离、鉴定及药敏分析，为奶牛乳腺炎的预防和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 质控菌株：链球菌ATCC32210、金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌ATCC25922，均购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。

随机对吴忠市6个规模化奶牛场采集奶样，采集正常奶牛前3把奶中乳样95份，用无菌试管接取5mL，加盖封紧，标明牛号、采样日期，样品采集后，置于冰盒中，于12 h内送到实验室，并立即处理和检测。

营养肉汤，普通营养琼脂，高盐甘露醇培养基，伊红美蓝培养基，麦康凯培养基，马丁琼脂培养基等，购自杭州天和微生物试剂有限公司；葡萄球菌选择性琼脂110，三糖铁培养基，细菌微量生化鉴定管等，购自青岛高科园海博生物技术有限公司。

药敏纸片：头孢唑啉（CZ）、阿莫西林（AMX）、卡那霉素（K）、环丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFL）、四环素（TE）、青霉素（P）、阿米卡星（AN）、头孢西丁（FOX）、庆大霉素（GM）、多西环素（DO）、磺胺甲硝唑/甲氧苄啶（SXT），均购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.2 方法

1.2.1 平板菌落计数法 随机从每个奶牛场抽取3个样品，每个样品取50μL乳样于5mL肉汤培养基中37℃，150 r/min震荡培养18 h，然后将菌液依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，终体积为1mL，最后分别涂布于营养培养基上培养24 h，每个稀释梯度重复3次，隔天观察菌落数目，选择长有50～200个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量。计算公式如下：

每毫升样品中菌落形成单位数（CFU）=同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数×5。

1.2.2 病原菌的分离培养及形态观察 将采集的乳样充分摇匀后，分别用接种环接种于肉汤培养基中，37℃，培养24 h。然后于营养琼脂平板、伊红美蓝平板、麦康凯平板、甘露醇高盐平板划线37℃，24～48 h培养后，观察细菌的培养特性。根据菌落的形态特征，将不同菌落的菌分别接种于肉汤培养基中培养24 h后，划线于营养琼脂平板上通过革蓝染色区分出革蓝阳性菌和革蓝阴性菌，以及球菌和肠杆菌，通过触媒试验区分出葡萄球菌和链球菌，从而结合不同细菌在鉴别培养基中的生长情况初步判定细菌的类属[5]。

1.2.3 病原菌的鉴定试验

1.2.3.1 甘露醇发酵产酸试验 将已分离纯化好的葡萄球菌在葡萄球菌属选择培养基上划线培养24 h后，用0.04%溴麝香草酚蓝指示剂滴加于菌落，如变为黄色，即为阳性。

1.2.3.2 明胶液化试验 将已分离纯化好的葡萄球菌在葡萄球菌属选择培养基上划线培养24 h后，将硫酸铵饱和水溶液滴加于菌落，10min后，如围绕菌落出现一清晰带，即为阳性。

1.2.3.3 生化管鉴定试验 将已分离并纯化培养的各种细菌划线于营养培养基上，18～24 h，37℃培养。挑取单个菌落于微量生化管内，培养24～48 h，观察生化管内颜色的变化，并同时以链球菌ATCC32210、金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠埃希菌ATCC25922为质控菌株。

1.2.4 药敏试验 将分离鉴定的革兰阴性杆菌和葡萄球菌直接接种于普通肉汤培养基，链球菌接种于血清肉汤培养基，37℃，24 h培养。用培养基稀释至0.5麦氏比浊度，将棉签浸泡在菌液中10min后均匀涂布在培养基上，温室下放置5min，使表面的菌液稍干燥，然后用无菌镊子将13种药敏纸片分别贴到平板上，在培养箱37℃培养24 h后测量抑菌圈直径，判定试验菌株对各种抗生素的敏感度。每株试验3次，取其抑菌圈值的平均值[6]。

2 结果

2.1 牛奶中细菌总数 采用平板菌落计数法对6个奶牛场中前3把奶中的细菌总数进行测定，结果显示，牛场1、牛场2、牛场3、牛场4、牛场5和牛场6中细菌总数分别达到2×108CFU/mL、3×108CFU/mL、2×108CFU/mL、4×108CFU/mL、3.5×108CFU/mL和2.5×109CFU/mL。通过以上数据可知，这6个奶牛场中正常产奶牛前3把奶中的细菌数明显高于鲜奶细菌总数（低于2×105CFU/mL）质控指标[7]。

2.2 病原菌培养及形态特性

2.2.1 大肠埃希菌 在营养琼脂平板上为白色大菌落，在麦康凯平板上形成中等大小、表面光滑、湿润的红色菌落，在伊红美蓝平皿上为黑色带有金属光泽菌落，在三糖铁培养基上斜面和底部均为黄色，革兰染色油镜下为短杆状单个或成对存在的革兰阴性菌，则可初步判断为大肠埃希菌[8]。

2.2.2 葡萄球菌 在营养琼脂培养基上生长良好，在高盐甘露醇培养基上凝固酶阳性菌形成金黄色、光滑、隆起的中等大小菌落，且通过甘露醇发酵产酸试验、明胶液化试验、凝固酶试验和触媒试验均为阳性，则可初步确定为金黄色葡萄球菌。凝固酶阴性菌在高盐甘露醇培养基上呈红色、光滑、隆起的中等大小菌落，甘露醇发酵产酸试验、明胶液化试验和凝固酶试验为阴性，触媒试验为阳性[9]。

2.2.3 链球菌 在营养琼脂和麦康凯平板上生长不良，在马丁琼脂平板上生长良好，菌落为露滴状、圆形、隆起、透明、表面光滑、湿润的小菌落，凝固酶试验和触酶试验均为阴性，革兰染色后在油镜下成双或短链状、长链状排列则可初步判断为链球菌[10]。

2.3 病原菌的生化特性 主要病原菌的生化特性结果见表1。结合不同菌株的生化特性、培养特性及形态特征，判定菌株的类型为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和链球菌。

表1 主要病原菌的生化鉴定结果

2.4 细菌的分离培养与鉴定 95份乳样中有78份乳样检测出有细菌生长，共分离得到4种优势病原菌共102株，其中62株大肠埃希菌，检出率为65.3%；33株金黄色葡萄球菌，检出率为37.3%；链球菌7株，检出率为6.9%。结果表明，这些分离菌广泛存在于该地区奶牛场的正常牛群中。

2.5 药敏试验结果 通过K-B法测定分离菌株的耐药情况显示，所分离的菌株对临床常用的抗菌药存在一定程度的敏感性，且多数菌株仅对青霉素存在严重的耐药性。耐药率从高到低依次为：青霉素、庆大霉素、四环素、磺胺甲氧嘧啶、卡那霉素、环丙沙星、氧氟沙星、阿米卡星、头孢西丁、多西环素、阿莫西林、头孢唑啉（表2）。

结果判断，依据《抗菌药物敏感性试验执行标准（第十七版信息增刊）》进行[11]。

6个牛场中临床分离株的耐抗生素情况如图1和表2所示，102株分离株对临床常用抗生素多表现为耐1-2种抗生素，且对环丙沙星和头孢唑啉存在一定程度的敏感性，其敏感率达到96.7%，但各菌株均对青霉素存在很大程度的耐药性，其耐药率达到了100%。

表2 抗生素对临床分离菌株的敏感性

3 讨论

奶牛乳腺炎严重危害着奶牛养殖业的发展，主要表现在产乳量，废弃牛奶，治疗成本以及劳动力等方面。近年来，随着奶牛乳腺炎发病率的逐年增高，废弃牛奶的量也越来越大，其主要原因是此类牛奶不但影响着奶牛自身的健康同时，也影响着鲜奶的品质以及幼畜的健康成长。而通常在挤奶过程中，由于前3把奶中含有的细菌数比较高，且奶牛喜欢卧地反刍和休息，接触地面（特别是当地面较污浊时）的奶牛乳房容易沾有大量细菌，而从乳头开始到乳房内部有一个乳导管，细菌容易进入乳导管，并在此生长繁殖。因此首先要弃掉前3把奶，然后用一定比例的消毒水喷洒乳头，再用高温消毒过的毛巾，一对一的擦干净奶牛的乳房开始挤奶。并且对弃奶要用专门容器收集，这样可以避免废弃在地面上的牛奶污染环境，导致病原微生物传播感染；也能更容易在专门的容器里观察牛奶中是否有凝块、絮状或水样奶，以及时发现临床乳房炎，做到及时治疗并防止患乳房炎的牛奶混入正常奶中。

图1 不同细菌耐受抗生素种类分布

本试验从6个规模化奶牛场中，随机采集正常产奶奶牛前3把奶样95份，对此95份乳样进行细菌总数的测定，发现前3把奶中细菌的总数明显高于鲜奶中细菌的总数，这提示着我们如果不合理的控制此类病原菌的生长和繁殖，将会增加奶牛患各种疾病的概率。通过对病原菌的分离鉴定中可以了解到，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和链球菌为前3把奶中的优势病原菌，这些病原菌通常是引起奶牛患乳腺炎和其他疾病的重要致病菌[13]。所分离的102株病原菌药敏试验结果表明，环丙沙星、头孢唑啉、阿莫西林、多西环素、头孢西丁、阿米卡星等药物对这6个规模化奶牛场中前3把奶中优势病原菌具有高度的敏感性。在本试验结果中，约100%的分离株对青霉素高度耐药，这与6个奶牛场常用青霉素作为临床治疗药物的结果相一致，且与张珠明对此地区的研究结果相似[14]。因此，可根据本试验的结果选择环丙沙星等抗生素类药物用于治疗该地区奶牛乳腺炎等疾病。同时通过此次试验可以发现，虽然目前对引发奶牛乳腺炎的病原菌的研究较多，但为了更好的预防和控制奶牛乳腺炎的产生，需尽早对未患病的正常牛群中病原菌的分布特点、病原菌的种类及耐药程度进行研究，从而在细菌未感染到奶牛乳房内而将其杀死，降低奶牛乳房炎等疾病的发生。

[1]Bannerman D D.Pathogen-dependent induction of cytokines and other solublei-nflammatorymediators during intramammary infection of dairy cows[J].American Society of Animal Science，2009，87（1）：10-25.

[2]张连梅，赵兴绪，张勇，等.甘肃省及周边地区奶牛乳腺炎致病大肠杆菌的分离鉴定及其种系分群的研究[J].中国兽医科学，2013（04）：339-344.

[3]Ballou M A Role in the etiology and pathophysiology of clinical mastitis in dairy cows[J].American Society of Animal Science，2012，90：1466-1478

[4]JoséBenedito C.Fernandes,Larissa G.Escherichia coli from clinical mastitis：serotypes and virulence factors[J].Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，2011，23（6）：1146-1152.

[5]王东，李发万，王旭青，等.宁夏部分地区奶牛乳腺炎病原菌的分离鉴定[J].动物医学进展，2012（08）：119-122.

[6]张磊，冯雪领，秦建华.奶牛乳腺炎大肠埃希菌的分离鉴定及药敏试验[J].广东农业科学，2011（13）：97-99.

[7]易敏英，李志勇.电阻抗法快速检测鲜牛奶中细菌总数[J].中国乳品工业，2001，29（3）：30-31.

[8]乌兰巴特尔.呼市地区奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定及基因分型[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2007.

[9]杨霞，杜艳芳.猪链球菌的分离与鉴定[J].河南科技大学学报：自然科学版，2007，28（5）：60-64.

[10]李成君，陈德娜，杨睿，等.奶牛乳房炎病原菌的分离与鉴定[J].黑龙江畜牧兽医：科技版，2012（10）：105-107.

[11]孙长贵，成军.2007年CLSI文件MI00-S17主要更新内容介绍[J].国际检验医学杂志，2007，28（12）：1148-1150.

[12]Ballou M A.Role in the etiology and pathophysiology of clinical mastitis in dairyCows[J].American Society of Animal Science，2012，90：1466-1478.

[13]刘萍，郝满良，叶宝娜，等.奶牛乳腺炎的研究进展[J].湖北畜牧兽医.2006，11：20-22.

[14]张珠明，汪仁莉，何生虎.吴忠市奶牛乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验[J].现代农业科技，2009，17：307-308.