香兰素吸嗅对大鼠抑郁样行为及脑单胺类神经递质的影响

刘 扬，许 慧，徐金勇，李光武

抑郁症(major depressive disease，MDD)的治疗目前主要采用5-HT 再摄取抑制剂(SSRI)等抗抑郁药物。在肯定这些新型抗抑郁药研究成果的同时，其疗效、毒副作用及给药途径等依然需要研究者的继续改进。嗅觉中枢与情绪功能脑区有着重叠。本实验室以往研究发现芳香物质的吸嗅可以改善小鼠抑郁样行为以及学习记忆，参与情绪、学习记忆相关脑区的激活［1］。经嗅觉通路的给药途径起效快、且可能避免外周副作用。香兰素(vanillin)为一种广泛使用的可食用香料，具有浓郁的奶香，能给人带来积极的愉快的情感体验，且具有抗癫痫、抗焦虑的作用［2］。本实验通过让抑郁模型大鼠吸嗅含有香兰素的水蒸气，观察香兰素吸嗅对抑郁大鼠行为学的改变，并检测干预后各组大鼠脑匀浆液5-HT、DA、NE 的量，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与主要试剂 WabLab 动物行为视频分析系统(淮北软隆科技公司)，大鼠饮水瓶(上海生工公司)，低温离心机(eppendorf，German)超声匀浆机(Bio-block Scientific，France)，超高压液相色谱-荧光检测器(Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7 μm，American)，BCA 蛋白试剂盒(上海生工公司)，香兰素晶体(上海生工公司)，盐酸氟西汀胶囊(上海中西制药有限公司)，5-HT、DA、NE 标准品(Sigma-aldrich，American)。

1.2 实验动物与分组 SD 大鼠50 只(安徽医科大学动物中心提供)，SPF 级，体重220～250 g，雄性，适应性饲养1 w，室温为(22±3)℃，正常昼夜节律，期间动物可自由饮水、摄食。抑郁造模后大鼠随机分为5 组:实验组:CUMS+香兰素吸嗅(Ⅰ组)、阳性对照组:CUMS+氟西汀灌胃(Ⅱ组)、空白对照组:CUMS+纯水蒸气吸嗅(Ⅲ组)，为了验证香兰素作用途径，设立OBX+香兰素吸嗅组(Ⅳ组)和嗅球毁损假手术组(Ⅴ组)。

1.3 抑郁造模

1.3.1 CUMS+孤养的方法建立大鼠抑郁模型参考文献［3］，大鼠每天接受一种随机刺激，包括:禁食24 h、禁水24 h、冷水游泳(4 ℃，5 min)、热水游泳(45 ℃，5 min)、昼夜节律颠倒、摇晃(5 min)、夹尾(3 min)。持续刺激4 w。

1.3.2 大鼠嗅球毁损(OBX)模型 OBX 是经典的抑郁症造模方式，常用于抗抑郁药的作用机制的研究，本实验为了阐明香兰素是否通过嗅觉通路起作用，故采用离断大鼠嗅觉通路造成大鼠抑郁，然后让大鼠吸嗅香兰素来佐证。参考文献［4］及结合实际，用10%水合氯醛按大鼠体重(g)×(300 μl/100 g)的量腹腔注射麻醉大鼠，大鼠全麻后头部固定于脑立体定位仪上，大鼠腹部垫在恒温毯上，在两耳连线中点处做纵形切口暴露颅骨，在距前囟7 mm，与正中缝两侧旁开1.8 mm 的交点处，用牙科钻将颅骨钻两个直径约2 mm 的小孔，用注射器针头搅动破坏嗅球后并吸出，可吸收明胶海绵填入小孔止血。假手术组大鼠采用相同的手术方法，但颅骨钻孔后不破坏嗅球。用碘伏清洗好伤口后缝合皮肤。手术结束后将大鼠分笼饲养，以防伤口开裂感染。

1.4 干预方法

1.4.1 Ⅰ组 参考文献［5］，将香兰素晶体用热水溶于烧杯，盛有香兰素溶液的烧杯置于密闭的实验盒底部，底部上面20 cm 高度铺有一层带有许多孔的薄塑料栅栏，待香兰素水蒸气充分挥发弥漫至整个实验盒内，将大鼠放置于塑料栅栏上，将实验盒盖盖上，大鼠吸嗅0.5 h 后，将动物取出放回笼中，3 次/d，持续4 w。

1.4.2 Ⅱ组 氟西汀按大鼠体重(g)×(10 mg/kg)灌胃，1 次/d，持续4 w。

1.4.3 Ⅲ组 大鼠置于实验盒中吸嗅纯水蒸气，3 次/d，持续4 w。

1.4.4 Ⅳ组 干预方法同Ⅰ组。

1.4.5 Ⅴ组 正常饮水饮食，不予干预，观察4 w。

1.5 神经行为学观察

1.5.1 强迫游泳实验(Forced swimming test，FST)将大鼠放入WabLab 动物行为视频分析系统的圆柱形游泳桶中，桶底直径20 cm、高45 cm，水温25±1 ℃，水深30 cm 大鼠在游泳桶中适应环境1 min，然后通过视频分析系统记录大鼠5 min 游泳的不动时间，不动阈值设置为“7”，大鼠游泳的不动时间为停止挣扎或漂浮在水面仅有细小肢体动作的时间。于造模前、造模后和治疗4 w 后检测各组大鼠FST 不动时间。

1.5.2 糖水消耗实验(Sucrose consumption test，SCT) 大鼠禁食、禁水24 h 后，将大鼠的饮水瓶内加入10 g/L 蔗糖溶液足量，计算24 h 内饮用蔗糖溶液的质量。于造模前、造模后和治疗4 w 后检测各组大鼠糖水消耗量。

1.6 脑匀浆液5-HT、DA、NE 的检测 通过UPLC-FLR(超高压液相色谱-荧光检测器)检测各组大鼠脑匀浆液内5-HT、DA、NE 的量，通过蛋白试剂盒(BCA protein assay kits)检测各组大鼠脑匀浆液可溶性蛋白含量(Pr)作为内标。然后记录每只大鼠脑内单胺类神经递质的含量和Pr 的比值作为组间对照，反应各组间神经递质含量的差异。

1.6.1 样本采集及处理 治疗4 w 后将大鼠用水合氯醛全麻后取脑，脑组织放在盛有PBS 液的培养皿中，小心剔除脑表面的血管及脑膜，称量后置于离心管中加入PBS 液(脑组织∶PBS 液=1 g∶10 ml)超声匀浆，低温离心10 min(10 000 r/min，4 ℃)，将所得上清液再离心1 次，保存于-80 ℃冰箱中备用。样品在进样前先低温解冻，再加入等体积5%高氯酸，放置20 min，低温离心15 min(14000 r/min，4 ℃)，上清液用来进样分析。

1.6.2 色谱条件和荧光检测参数 色谱柱为C18 柱(BEHC 18 1.7 μm 2.1×1000 mm)，参阅文献［6］及考察效果后，NE、DA 的分离条件流动相选用柠檬酸鈉-乙酸钠缓冲液(50 mmol/L 柠檬酸、50 mmol/L 乙酸钠、0.5 mmol/L 1-庚烷磺酸钠、5 mmol/L 三乙胺、0.5 mmol/L Na2EDTA)-甲醇(90∶10，v/v)(pH=3.8)，流速为0.3 mmol/L;进样量5 μl;荧光激发波长为280 nm，发射波长为330 nm。5-HT 的分离流动相选用0.1 mol/L KH2PO4-甲醇(80∶20，v/v)(pH=4.3)，流速为0.3 ml/min;进样量5 μl;荧光激发波长278 nm，发射波长338 nm。

1.6.3 标准储备液的制备 精确称量5-HT、DA、NE 标准品，分别置于10 ml 容量瓶中，加入标准品溶剂(0.5 mmol/L Na2EDTA、0.1 g/L L-半胱氨酸、0.01 mmol/L 高氯酸的混合水溶液)，充分摇匀后配置成0.1 mg/ml 的标准储备液，置于4 ℃冰箱保存，使用时将标准储备液逐级稀释至所需浓度。

1.6.4 标准曲线方程的绘制 参阅文献［6］，精密称量5-HT、DA、NE 标准品，将其定量混合，用标准品溶液稀释，得到一系列质量浓度不同的溶液。用0.22 μm 滤膜过滤后按1.6.2 节的色谱条件进样分析。以进样质量浓度X(μg/L)对峰面积Y 作图，绘制标准曲线。

2 结果

2.1 大鼠糖水消耗实验结果 与造模前相比，造模后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组大鼠糖水消耗量显著减低(P＜0.05)，Ⅴ组无显著差异(P＞0.05)。与造模后相比，干预4 w 后Ⅰ组、Ⅱ组大鼠糖水消耗量显著增加(P＜0.05)，Ⅲ组，Ⅳ组、Ⅴ组未见显著性差异(P＞0.05)(见图1)。

2.2 大鼠强迫游泳不动时间结果 与造模前相比，造模后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组大鼠强迫游泳不动时间显著增加(P＜0.05)，Ⅴ组无显著差异(P＞0.05)。与造模后相比，干预4 w 后Ⅰ组、Ⅱ组大鼠强迫游泳不动时间显著降低(P＜0.05)，Ⅲ组，Ⅳ组、Ⅴ组未见显著性差异(P＞0.05)(见图2)。

图1 各时间点大鼠糖水消耗量

图2 各时间点大鼠强迫游泳不动时间

2.3 内标蛋白量 见表1。

表1 大鼠脑匀浆液蛋白量(Pr)(±s)

表1 大鼠脑匀浆液蛋白量(Pr)(±s)

2.4 5-HT、NE、DA 标准方程和色谱图 标准曲线方程见表2。5-HT 标准品色谱图见图3A1，脑匀浆液5-HT 色谱图见图3A2;DA、NE 标准品色谱图见图3B1，脑匀浆液5-HT 色谱图见图3B2。

2.5 脑匀浆液5-HT、DA、NE 与Pr 的比值图4A 可见:与Ⅲ组比较，Ⅰ组和Ⅱ组大鼠脑匀浆液内5-HT/Pr 显著升高(P＜0.05)，图4B 可见:与Ⅲ组比较，Ⅰ组大鼠脑匀浆液DA/Pr 显著升高(P＜0.05)，而Ⅱ组未见显著性差异(P＞0.05)。图4C可见:与Ⅲ组比较，Ⅰ组和Ⅱ组大鼠脑匀浆液NE/Pr未见显著差异(P＞0.05)。图4D、图4E、图4F 可见:与Ⅴ组比较，Ⅳ组大鼠脑匀浆液5-HT/Pr、DA/Pr、NE/Pr 均显著下降(P＜0.05)。

图3 标准品及样本5-HT、DA、NE 色谱图

图4 各组大鼠脑匀浆5-HT/Pr、DA/Pr、NE/Pr 的值

表2 5-HT、NE、DA 的回归方程、线性范围及相关系数

3 讨论

嗅质(odorant)除了传到皮质产生嗅觉外，还可以传至邻近脑区，参与情绪活动。嗅觉系统形态学上可以被划分为嗅上皮(olfactory epithelium)，嗅球(olfactory bulb)和嗅皮质(olfactory cortex)3 部分。Axel 揭示了嗅觉的工作原理［7］，嗅质与鼻腔内嗅上皮特异性的嗅感受神经元(olfactory receptor neurons，ORNs)结合后引发嗅觉感受器电位，沿着嗅感觉神经元轴突传递至嗅球，信息在嗅球内加工修饰，形成时间和空间编码。编码后的信息传递到嗅皮质进行解码从而表达。嗅皮质为嗅觉系统的二级嗅觉中枢。嗅皮质主要包括了AON、嗅结节(olfactory tubercle，OT)、梨状皮质(piriform cortex)、内嗅皮质(entorhinal cortex)、杏仁体周围区等。

嗅觉与大脑的边缘系统的联系是最直接的，形态学和电生理的研究发现嗅觉系统与杏仁体、海马、下丘脑之间有广泛的纤维联系［8，9］;fMRI 的研究结果表明气味刺激可以激活大脑额叶和颞叶区［10］;PET-CT 的研究显示气味物质在额叶内侧边缘系统、眶额叶皮质等区域引起明显活化。嗅觉和情绪系统的加工在在解剖位置上高度重叠，嗅觉的中枢结构杏仁核、海马、眶额皮质和岛叶也是情感中枢的主要结构。本实验室以往的研究发现丁香酚精油的吸嗅可以改善小鼠抑郁样行为，并且在小鼠嗅球、杏仁核、海马、下丘脑等部位可以快速地记录到丁香酚所诱发的特征性生物电变化［11］，研究还发现薰衣草的吸嗅可以改善小鼠抑郁样行为，并使小鼠杏仁核、海马、下丘脑内5-HT 表达明显增加［12］。

MDD 的发病机制是多方面的，经典的单胺能递质理论认为MDD 发病是由于突触间隙单胺类神经递质异常减少引起，临床上也主要通过提高突触间隙5-HT 水平达到抗抑郁作用。DA 的降低导致嗜睡、兴趣下降、以及厌食等，抑郁发生率增加，抗DA药物倾向致抑郁，拟DA 药物倾向抗抑郁［13］。情感性精神障碍的DA 理论认为，DA 能神经传递缺乏可能在MDD 的症状中起主要作用。抑郁症与多巴胺受体及转运体基因之间的联系也是近期研究的热点［14］。抑郁的发病机制也涉及NE 系统的失调。中枢NE 的活动既能产生促抑郁又有抗抑郁效应，这种矛盾取决于应激是否能预测以及急性还是慢性。此外，NE 与5-HT 能神经元之间存在相互作用，这两种神经元系统之间相互作用及对其他脑区的调控是抗抑郁药起效时间及效果差异的机制。

综上所述，香兰素吸嗅4 w 可以改善CUMS 导致的大鼠抑郁样行为，其疗效类似于氟西汀的疗效，而对OBX 导致的抑郁无效。其机制可能是经嗅觉通路提高脑内5-HT、DA 水平所实现的。吸嗅的给药途径较临床其他抗抑郁药方便，且无需经过肝、肾代谢从而造成肝、肾功能的损害。香兰素抗抑郁作用机制仍需进一步研究，其疗效还需得到更多临床试验的证实。

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