抗菌肽magaininⅡ的密码子优化及在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达

陈玉海，陈庆煌，陈科，章亭洲，陈吉龙,

1 中国科学院微生物研究所 中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101

2 福建农林大学动物科学学院 动物医学系，福建 福州 350002

3 浙江工商大学环境科学与工程学院，浙江 杭州 310035

抗菌肽是生命体抵御外界病原微生物入侵的过程中产生的一种小分子多肽，对细菌、真菌、原虫、病毒甚至癌细胞等都具有杀伤作用[1-11]。抗菌肽种类繁多，广泛存在于动物、植物以及细菌体内，是机体抵抗外界病原微生物入侵的天然防御系统的重要组成部分，是机体天然免疫系统的重要效应分子[12-17]。抗菌肽不同于传统抗生素，它具有独特的杀菌机制，不易使病原菌产生耐药性，且不会对机体正常细胞造成损害[18]。因此，抗菌肽是一种具有广阔开发前景的抗菌制剂，在医药卫生、食品工业、畜牧业等行业中有广泛的应用和市场前景。目前，从各种生物中筛选、鉴定以及人工改造与合成抗菌肽已成为抗菌物质发展的热点领域之一[19-24]。然而，抗菌肽的表达与纯化困难制约了它们的应用。

1987年Zasloff从非洲爪蟾皮肤中分离出了两种具有广谱抗菌活性的抗菌肽，即magaininⅠ和 magaininⅡ[25]；随后 Giovannini等证实抗菌肽 magainin大量储存于非洲爪蟾皮肤的颗粒腺中[26]。其中抗菌肽magaininⅡ有23个氨基酸组成，分子量为 2.47 kDa，具有两亲性和螺旋结构，在低浓度下即能够对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、原虫、肿瘤等都具有杀伤作用[4,8,25,27]。有趣的是，同是来源于非洲爪蟾的另一种抗菌肽PGLa与magaininⅡ在杀菌、抗肿瘤方面具有很好的协同效应[28-33]。基于抗菌肽magaininⅡ、PGLa的上述功能，本文主要探讨抗菌肽 magaininⅡ和杂合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa在细菌和毕赤酵母中的表达以及纯化策略，为后续生产应用提供一定前期指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 载体和菌种

毕赤酵母表达载体pPIC9k，表达菌株KM71为中国科学院微生物研究所邱并生研究员惠赠；原核表达载体 pGEX-5x-3，表达菌株大肠杆菌Rostta(DE3)为本室保存。

1.1.2 试剂

限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自NEB(北京) 有限公司；质粒提取试剂盒，凝胶纯化回收试剂盒，酵母基因组提取试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司；Flag、his等抗体购自Sigma-Aldrich等公司；Glutathione Sepharose 4B购自GE Healthcare公司。

1.1.3 密码子优化前后的基因与对应氨基酸序列

抗菌肽 magaininⅡ以及杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa分别按照大肠杆菌和毕赤酵母偏好性密码子进行优化。

magaininⅡ按照大肠杆菌偏好性密码子进行优化，优化前后序列如下：

magaininⅡ-PGLa按照毕赤酵母偏好性密码子进行优化，优化前后序列如下：

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽 magaininⅡ以及杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa的基因序列优化与合成

利用Jcat (http://www.jcat.de/) 等软件，按照大肠杆菌E. coli密码子偏好性优化magaininⅡ的基因序列，同时，按照毕赤酵母密码子偏好性优化magaininⅡ-PGLa杂合抗菌肽的基因序列，并在北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成优化后的序列。

合成的magaininⅡ序列氨基端含有his/flag标签，表达后可以用肠激酶切割得到天然的不带任何其他氨基酸残基的 magaininⅡ抗菌肽，为进一步研究表达的抗菌肽 magaininⅡ的活性提供保证。为便于后续检测，合成的杂合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa氨基端也含有 his/flag标签。

1.2.2 抗菌肽magaininⅡ的原核表达及纯化

利用限制性内切酶 EcoRⅠ和 XhoⅠ将合成的抗菌肽 magaininⅡ基因构建到原核表达载体pGEX-5x-3中。测序无误后，利用大肠杆菌Rostta(DE3)菌 株 在 22 ℃ 、IPTG 浓 度 为0.1 mmol/L的条件下诱导抗菌肽 magaininⅡ表达，超声裂解后的上清部分含有融合蛋白GST-magaininⅡ，上清利用Glutathione Sepharose 4B 进行亲和层析，并用前切割蛋白酶(PreScission Protease) 进行柱上切割 (On-column cleavage)，之后用 PBS (Phosphate buffered solution) 缓冲液洗脱，得到纯化的抗菌肽，即不含GST标签的可溶性抗菌肽magaininⅡ。

1.2.3 含天门冬氨酸-脯氨酸二联氨基酸抗菌肽(DP-magaininⅡ)的原核表达与纯化

据文献报道，稀酸可以切割天门冬氨酸和脯氨酸之间的肽键，可以用于重组蛋白特别是包涵体蛋白的纯化[10,34-35]。以合成的密码子优化过的抗菌肽基因为模板，构建氨基端含有天门冬氨酸-脯氨酸的magaininⅡ抗菌肽DP-magaininⅡ，采用大肠杆菌Rostta (DE3)菌株在37 ℃、IPTG浓度为 0.6–1.0 mmol/L的条件下诱导抗菌肽DP-magaininⅡ的表达，并利用不同浓度的盐酸对表达的GST融合抗菌肽进行切割。

1.2.4 杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa毕赤酵母表达载体的构建

将合成的magaininⅡ-PGLa杂合抗菌肽，克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9k中，获得pPIC9k-magaininⅡ-PGLa以及 pPIC9k-his/flagmagaininⅡ-PGLa。

1.2.5 毕赤酵母KM71的电转化与杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa在毕赤酵母KM71中的整合情况检测

利用限制性内切酶SalⅠ将毕赤酵母表达载体 pPIC9k、pPIC9k-magaininⅡ-PGLa、pPIC9khis/flag-magaininⅡ-PGLa (各 5 μg) 分别线性化，利用电转仪转化毕赤酵母 KM71感受态细胞 (参数：1.5 kV，200 Ω，25 μF)，涂布 MD(Minimal Dextrose) 平板，待菌落长出，挑单克隆传3代后用含0–4.0 g/L G418 的YPD (Yeast extract peptone dextrose) 平板进行筛选。同时提取所筛选酵母的基因组DNA，并利用Invitrogen公司说明书中提供的5'AOX1和3'AOX1引物序列，合成引物，检测杂合抗菌肽在毕赤酵母基因组中的整合情况。

1.2.6 杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa在毕赤酵母中的表达及检测

挑纯化后的稳定整合杂合抗菌肽基因的酵母菌单克隆于 BMGY (Buffered glycerolcomplex medium) 培养基中，28 ℃、200 r/min培养至对数期，然后转接至 BMMY (Buffered methanol-complex medium) 培养基，每24 h加入0.5%的甲醇诱导表达。在不同时间点取上清，采用双抗夹心ELISA方法检测杂合抗菌肽的表达情况，具体方法如下：1) 用碳酸盐缓冲液在ELISA板中包被一抗 (flag抗体)，4 ℃过夜；2)第2天，用含0.05% Tween 20的PBS洗液充分冲洗后加入 200 μL 封闭液 (PBS+1% BSA)，37 ℃封闭1 h；3) 用洗液充分冲洗后加入毕赤酵母表达的抗菌肽 100 μL (含有 his和 flag 标签)，37 ℃孵育 1 h；4) 用洗液充分冲洗后加入酶标二抗(His-HRP抗体)，37 ℃孵育1 h；5) 用洗液充分洗脱后加入TMB底物溶液100 μL，37 ℃避光反应15 min；6) 加入2 mol/L硫酸溶液50 μL终止反应，3–5 min后用酶标仪检测，波长和参考波长分别是450 nm和630 nm。

1.2.7 抗菌肽活性检测方法

抗菌肽活性检测方法如下：将过夜培养的大肠杆菌DH5α接种于LB培养基中，加入抗菌肽浓缩液 (10倍浓缩，以空载体表达产物作对照)，37 ℃振荡培养，在不同时间点取菌液测定菌体浓度，比较实验组和对照组的抑菌效果。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽magaininⅡ的原核表达

将构建好的原核表达载体pGEX-magaininⅡ转化Rosetta(DE3)菌株，在22 ℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L的条件下，诱导抗菌肽 magaininⅡ表达。分别在0、2、4、6、8、10 h取样检测融合蛋白表达情况，如图1所示，结果显示 GST融合抗菌肽得到了高效表达，约在8 h表达量达到最高，经超声后SDS-PAGE检测分析，蛋白主要以可溶性形式存在，利用前切割蛋白酶切割后获得特异的目标条带 (含有 his和 flag标签，其中flag标签内部含有肠激酶的切割位点)。

如图1所示，图1A是在不同的诱导时间下表达的 GST-magaininⅡ融合蛋白的 SDS-PAGE结果，图1B是利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析后的融合蛋白SDS-PAGE结果，图1C是利用前切割蛋白酶切割后的 Tricine-SDS-PAGE结果，图1D是GST融合蛋白的结构示意图。

2.2 抗菌肽 DP-magaininⅡ的原核表达与酸切割

在37 ℃，用IPTG诱导抗菌肽DP-magaininⅡ在大肠杆菌中的表达，初步纯化后用不同浓度的盐酸切割，纯化和切割结果如图2所示。

结果表明，抗菌肽DP-magaininⅡ在大肠杆菌中没有形成包涵体，重组蛋白以可溶形式存在，超声后上清利用0.000 1–1.0 mmol/L HCl在85 ℃条件下切割8 h，发现在1.0 mmol/L (pH约为 2.5) 盐酸进行切割时出现弥散条带(Smeared bands)，这与文献报道的最佳pH相符[10]，表明这一技术可以获得magaininⅡ多肽。

图1 抗菌肽magaininⅡ的原核表达与纯化Fig. 1 Expression and purification of recombinant magaininⅡfusion protein. (A) The expression of recombinant magaininⅡ fusion protein under different time gradient. M: prestained protein ladder (Fermentas, SM0671). (B)Purified recombinant magaininⅡ fusion protein. M: prestained protein ladder (Fermentas, SM0671); 1: recombinant magaininⅡ fusion protein after purification; 2: recombinant magaininⅡ fusion protein before purification. (C)Digestion of recombinant magaininⅡ fusion protein with PreScission Protease. M: prestained protein ladder(Fermentas, SM1861); 1: recombinant magaininⅡ fusion protein after purification; 2: recombinant magaininⅡprotein after digestion; 3: control. (D) The structure of the GST-magainin fusion protein. GST: glutathione S-transferase; PPS: preScission protease cleavage site; His: his tag; Flag: flag tag; EkS: enterokinase cleavage site.

图2 抗菌肽DP-magaininⅡ的原核表达与纯化Fig. 2 Expression and acid digestion of DP-magaininⅡ fusion protein. (A) The purification of recombinant DP-magaininⅡ fusion protein. M: prestained protein ladder (Fermentas, SM0671); 1: recombinant DP-magaininⅡfusion protein after purification; 2: recombinant DP-magaininⅡ fusion protein before purification. (B) Digestion of recombinant DP-magaininⅡ fusion protein with hydrochloric acid. M: prestained protein ladder (Fermentas,SM1861); 1–5: different concentrations of hydrochloric acid; 1: 0.000 1 mmol/L; 2: 0.001 mmol/L; 3: 0.01 mmol/L; 4:0.1 mmol/L; 5: 1 mmol/L.

2.3 杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa在毕赤酵母中的表达及检测

2.3.1 杂合抗菌肽的一级结构

杂合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa一级结构见图3，其中5'端为抗菌肽magaininⅡ，3'端为抗菌肽PGLa，中间用氨基酸序列为Gly-Gly-Cys-Cys-Gly-Gly含有二硫键的linker将两种抗菌肽连接起来。

图3 杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa的一级结构Fig. 3 Primary structure of the magaininⅡ-PGLa hybrid antibacterial peptide.

2.3.2 稳定表达杂合抗菌肽的毕赤酵母高产菌株的筛选

利用SalⅠ线性化pPIC9k-magaininⅡ-PGLa，pPIC9k-his/flag-magaininⅡ-PGLa以及空载体对照pPIC9k，电转化毕赤酵母KM71并传代，利用0–4.0 g/L的G418进行筛选，得到稳定整合杂合抗菌肽的酵母菌单克隆。由于转化 KM71得到的毕赤酵母表型都是甲醇利用缓慢型(Muts)，所以无需进行表型筛选，转化后毕赤酵母高产菌株的筛选流程见图4。

2.3.3 杂合抗菌肽在毕赤酵母中的整合情况检测

提取毕赤酵母基因组 DNA，利用 5'AOX1和3'AOX1引物扩增，电泳结果如图5所示，其中整合pPIC9K-magaininⅡ-PGLa的扩增片段为642 bp，整合pPIC9K-his/flag-magaininⅡ-PGLa的扩增片段为684 bp，对照扩增片段为492 bp。结果显示杂合抗菌肽已经稳定整合入了毕赤酵母基因组中。

图 4 表达杂合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa的毕赤酵母高产菌株的筛选Fig. 4 Screening of high-yielding strains of hybrid antibacterial peptide.

图5 杂合抗菌肽在毕赤酵母中的整合情况检测Fig. 5 PCR analysis of Pichia pastoris integrants. M:DNA marker; lane 1–3 show the 642 bp products from KM71/pPIC9K-magainin II-PGLa; lane 4 shows the 492 bp product from KM71/pPIC9K; lane 5-6 show the 684 bp products from KM71/pPIC9K-magaininⅡ-PGLa-his/flag.

2.3.4 杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa在毕赤酵母中的表达

分别在 0.5%甲醇诱导 0、48、72、96 h时取样，采用ELISA检测3株稳定整合杂合抗菌肽 his/flag-magainin II-PGLa的酵母菌表达情况，结果如图6A，结果显示，菌株1的表达水平明显高于其他菌株，且在72 h左右表达量达到最高。活性分析表明杂合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa对大肠杆菌 DH5α生长有一定抑制作用(图 6B)。

图 6 杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达水平及活性检测Fig. 6 Expression level and antibacterial activity of hybrid antibacterial peptide magaininⅡ-PGLa. (A)Expression level of hybrid antibacterial peptide in Pichia pastoris. (B) Antibacterial activity of hybrid antibacterial peptide to E. coli.

3 讨论

抗菌肽 magaininⅡ是非洲爪蟾皮肤颗粒腺分泌的一种抗菌肽，对细菌、真菌、原虫、肿瘤等都具有一定杀伤作用[4-5,8,19,28]。在临床上，抗菌肽magaininⅡ的衍生物Pexiganan (MSI-78)用于治疗糖尿病足溃疡 (Diabetic foot ulcers)，已完成了3期临床[36]。

据文献报道同是来源于非洲爪蟾皮肤的抗菌肽magaininⅡ和PGLa抗菌活性具有一定协同作用[28-33]，Katsumi Matsuzaki等预测Magainin和PGLa形成一种对膜有很强通透能力的，由平行的螺旋线组成的异源二聚体，其进一步研究显示杂合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa抑菌活性明显高于单独或者等摩尔混合的两种抗菌肽，且在膜表面形成螺线管虫洞的速率顺序是magaininⅡ/PGLa 等 摩 尔 混 合 ≥PGLa＞magaininⅡ，而螺线管虫洞的持续时间则是magaininⅡ＞magaininⅡ/PGLa等摩尔混合＞PGLa[29-30]。固相核磁共振研究表明，在低浓度下抗菌肽PGLa以单体形式存在，在膜表面处于表面态 (Surface-state)，当PGLa浓度升高时，在膜表面处于倾斜态 (Tilted-state)，在抗菌肽magaininⅡ存在时两者形成异源二聚体，处于插入状态 (Inserted-state)，进而在膜表面形成稳定的螺线管虫洞结构，使细菌内外的渗透压发生改变，从而起到协同杀菌的作用[33]。

直接从生物体内分离和纯化天然抗菌肽的过程非常复杂，而且生产成本高。利用细菌或毕赤酵母生产抗菌肽有可能实现抗菌肽的工业化生产，而且可以利用基因工程技术对抗菌肽进行有目的的改造，使抗菌肽的活性升高，溶血性降低，从而在一定程度上克服抗菌肽分子量小、易降解等困难。

本文主要探讨了抗菌肽 magaininⅡ的表达策略，首先采取原核 GST融合表达抗菌肽magaininⅡ以及 DP-magaininⅡ，并分别用蛋白酶和稀酸进行切割纯化。进而采取毕赤酵母分泌表达杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa。我们成功在细菌中对抗菌肽magaininⅡ实现了高效表达，原核融合表达虽然表达量比较高，但是一般处于天然状态的抗菌肽才具有最佳抗菌活性，而在此过程中用于切割的蛋白酶成本太高。为克服这一问题，我们尝试利用天门冬氨酸-脯氨酸二联氨基酸中肽键对酸的敏感性，设计了含有这两个氨基酸的抗菌肽 DP-magininⅡ，在初步纯化后进行了切割检测，结果显示利用酸切有切割效果，但尚需进一步优化条件，同时构建抗菌肽magaininⅡ的串联体，以获得大量抗菌肽。

本研究还设计和构建了杂合抗菌肽magaininⅡ-PGLa载体，并在毕赤酵母中进行了表达实验，获得了预期的结果，通过ELISA分析抗菌肽his/flag-magaininⅡ-PGLa成功获得了分泌表达。magaininⅡ-PGLa在酵母菌菌株1中比其他两个菌株分泌表达量高，原因可能是整合到酵母染色体上的目的基因拷贝数不同，从而使同一基因在不同菌株中的表达不尽相同。活性分析显示杂合抗菌肽 magaininⅡ-PGLa有一定抗菌活性。下一步需要进一步优化发酵条件，大量表达magaininⅡ-PGLa杂合抗菌肽并优化纯化方式，进一步提高抗菌活性，为后续大规模发酵生产奠定基础。

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