鼠脑驱动蛋白ATP水解机制的晶体学分析

万群，祝娉婷，吕后宁，陈欣虹

扬州大学医学院生化系，扬州 江苏 225001

常规驱动蛋白在细胞器 (Organelle) 和囊泡 (Vesicle) 的运输中起着重要的作用[1-2]。了解常规驱动蛋白的结构将有助于对它的运输功能的深入理解。以往的研究表明，它的头部由两个马达区域 (Motor domain) 构成，并结合在微管系统上。尾部和将要转移的细胞器或囊泡结合。颈和躯干则将头尾分开[2]。常规驱动蛋白的马达区域利用ATP水解释放的能量采用双手交替模式 (Hand-over-hand mechanism) 沿微管系统高度连续性地运动[3]：一个头处于ADP结合状态，同微管分开。另一个头处于 ATP或ADP·Pi状态，同微管紧密结合。当ATP水解并释放出Pi后，这个头部离开微管。同时另一个头部的ADP被ATP取代，并结合到微管上去。理解ATP中储存的化学能是如何连续转化为机械动能的机制是研究常规驱动蛋白功能的重要课题。获得马达区域同ATP结构类似物复合物和ADP复合物的晶体结构能在原子水平了解上述功能。

鼠脑驱动蛋白是典型的常规驱动蛋白[4]。早在1997年它的马达区域同ADP复合物的晶体结构就已经发表[5]。但是直到现在，它同ATP结构类似物的复合物晶体一直未能得到。研究以鼠脑驱动蛋白为代表的常规驱动蛋白的ATP水解机制和化学能与机械能互换的机理就成为一个难点。本文作者将鼠脑驱动蛋白的马达区域在硫酸铵中沉淀结晶后，在酒石酸钾钠 (Sodium potassium tartrate) 中浸泡去除硫酸根离子，再将 ATP的结构类似物AMPPNP浸泡入活性中心，从而得到驱动蛋白同AMPPNP复合物的晶体结构。上述结果同以往的驱动蛋白·ADP复合物晶体结构的比较揭示了开关区域Ⅱ的Glu237起连接ATP的γ-磷酸和驱动蛋白微管结合区的枢纽作用。

1 材料与方法

1 试剂

阴离子交换树脂 Mono Q HR5/5购自美国Pharmacia公司。高氯酸 (Perchloric acid)、三乙胺碳酸氢盐 (Triethylammonium hydrogen bicarbonate)、酒石酸钾钠 (Sodium potassium tartrate)、对二氮己环-1,4-二(2-乙磺酸)(Piperazine-1,4-bis (2-ethanesulfonic acid), Pipes)缓冲液、Bradford试剂、BSA标准蛋白等试剂购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 腺苷酸的分析和纯化

结合在驱动蛋白中的腺苷酸采用阴离子交换色谱来分析[6]。约 4 nmol (100 mL，40 mmol/L)的驱动蛋白用 100 mL 10%三乙胺碳酸氢盐变性，从而释放出结合的核苷酸。变性蛋白以321 000´g的离心力20 min离心去除后，上清液加入40 mL中和液 (4 mol/L醋酸钾，10 mol/L氢氧化钾) 将 pH 调到 5–6。321 000´g离心20 min去除沉淀后，上清液加样到1 mL Mono Q阴离子交换柱。核苷酸用0−0.5 mol/L乙胺碳酸氢盐梯度洗脱。用标准浓度的不同核苷酸(ADP、AMP、ATP、AMPPNP、AMPPCP、ATPgS)在Mono Q阴离子交换柱洗脱后作为对照，可以对腺苷酸进行定性和定量。

ATP及其结构类似物 Adenylylimidodiphosphate (AMPPNP) 和 Adenosine 5′-[γ-thio]triphosphate (ATPgS) 含有少量的 ADP残余。由于ADP的亲和力比AMPPNP和ATPgS高，ADP必须从中去除，否则将影响上述结构类似物的结合 (详见下文)。AMPPNP、ATPg和ATP的纯化过程同上述分析过程类似，但是核苷酸的加样量提高为 4 mmol，洗脱剂为0−1 mol/L三乙胺碳酸氢盐。纯化的腺苷酸用冻干机在–40 ℃真空干燥，保存在–80 ℃冰箱备用。

1.2.2 驱动蛋白的结晶

野生型驱动蛋白以悬滴法在 18 ℃结晶：1 mL 蛋白溶液 (10 mg/mL 驱动蛋白、50 mmol/L Pipes缓冲液、500 mmol/L 氯化钠、5 mmol/L 氯化镁)同 1 mL 池液 (1.7 M/L 硫酸铵、500 mmol/L 氯化钠、20% (V/V) 甘油) 混合后与1 mL池液在封闭的环境下平衡。突变体E237A的悬滴法结晶条件如下：1 mL蛋白溶液(18 mg/mL 驱动蛋白、50 mmol/L Pipes缓冲液、500 mmol/L 氯化钠、5 mmol/L 氯化镁) 同 1 mL池液 (1.9 mol/L 硫酸锂、500 mmol/L 氯化钠)混合后，与1 mL池液在封闭的环境下平衡。

1.2.3 在酒石酸钾钠稳定液中浸泡 ATP结构类似物

将晶体从结晶溶液中捞出，浸泡在10 mL酒石酸钾钠稳定液[7-8](2.0 mol/L 酒石酸钾钠、30%甘油、120 mmol/L 氯化镁、77 mmol/L Pipes缓冲液) 中1 h，重复浸泡2次，最后再浸泡在含100 mmol/L ATP结构类似物的酒石酸钾钠稳定液中1 h。将晶体捞出，快速冷冻在液氮中。

1.2.4 晶体衍射数据的收集和处理

将驱动蛋白晶体从结晶溶液捞出后，立即在液氮中快速冷冻。由于结晶溶液中含 20%甘油作为冷冻保护剂 (Cryoprotectant)，冷冻的晶体周围不会有冰晶形成。驱动蛋白同ADP的复合物晶体衍射数据由 Rigaku RUH3R发生器和Mar345成像板构成的X-光衍射仪收集，其他复合物晶体衍射数据在上海同步辐射光源 (SSRF)光束线 BL17U1收集。所有数据用 HKL2000[9]软件处理。

1.2.5 晶体结构解析和展示

晶体结构解析以2kin.pdb[5]为模板，事先去除蛋白本身以外的所有分子，包括配体、水分子和离子。然后用 Phaser程序中的分子置换(Molecular replacement) 方法得到初始的结构[10]，最后用 CNS 程序[11]进行结构精算(Structure refinement) 和用 coot程序[11-12]对模型进行调整 (Model building)。晶体结构以Pymol程序[13]展示。

1.2.6 晶体结构的细微差别的分析

由于晶体浸泡后的晶胞参数和结构没有发生大的变化，蛋白与不同腺苷酸的复合物的晶体结构变化用同构差别图 (Isomorphous difference map)[14]来分析。在图中，红色表示电子云密度减小，绿色表示电子云密度增强。如果在蛋白模型附近同时有红色和绿色的变化，则表示蛋白的这段区域从红色区域向绿色区域移动。图中信号强度为3倍背景强度 (3s)。同构差别图用以下公式在CNS程序中生成：

注：DpobsF,是浸泡处理的晶体的结构因子的幅度 (Structural factor amplitude)，Fobs,p是没有处理的晶体的结构因子的幅度，calcp,F是无处理晶体的结构因子的相。

1.2.7 基础ATPase酶活 (Basal ATPase) 的测定

无微管激活时的驱动蛋白基础ATPase酶活(Basal ATPase activity) 用钼酸铵/硫酸亚铁混合液来测定在反应中释放的磷酸离子来测定[15]。具体过程如下：在 25 ℃将 2 mmol/L ATP和5 mmol/L MgCl2加入到 400 mL 含 0.3 mg/mL 驱动蛋白的反应液中。每10 min，从中取出50 mL反应液，混入50 mL灭活液 (140 mmol/L EDTA,20% SDS, pH 6.5)。200 mL 显色液 (2% 钼酸铵，0.5% 硫酸亚铁) 继而加入到上述混合液中，在25 ℃放置20 min显色。最后，已显色的溶液测定 OD700。用无机磷酸在钼酸铵/硫酸亚铁混合液中的 OD700值作出光吸收标准曲线后，ATP的水解速率 (r) 可以通过以下方程计算：

(注：OD/min是显色反应速率；nmols/OD是无机磷酸在钼酸铵/硫酸亚铁试剂中的标准曲线斜率；MW 是蛋白的分子量；对于 rK354，b值为1.68。)

2 结果与分析

2.1 驱动蛋白用硫酸铵结晶后的晶体结构

驱动蛋白和ADP的复合物用硫酸铵代替文献报道的硫酸锂[5]为沉淀剂结晶后，晶体分辨率可以达到2.0 Å (表1)。它的总体结构同文献报道的 (2kin.pdb) 非常类似 (图1)：将二者的主链Ca原子重叠后，均方根偏差 (Root mean square deviation，RMSD)只有0.59 Å。镁离子结合在由ADP 的b-phosphate、开关区域Ⅰ(SwitchⅠ)、开关区域Ⅱ (SwitchⅡ) 和磷酸结合环线(Phosphate-binding loop, P-loop) 组成的空洞中。镁离子的存在使得活性中心更加紧凑，有助于ADP结合在活性中心。新的晶体结构在3个局部区域同 2kin.pdb有所不同：a0螺旋 (氨基酸序列 18-28)、Loop 6 (氨基酸序列 121−129)、Loop 12 (氨基酸序列271−282)。这些不同是由于晶格排列 (Crystal packing) 在两种结晶条件下不同造成的。在硫酸铵条件下，位于腺嘌呤结合域的精氨酸14残基同晶格中邻近分子的谷氨酸125残基形成一个离子键 (3.2 Å)。该离子键起到悬臂效应，将a0螺旋抬高而远离腺苷酸(图2)。在硫酸锂条件下，上述两个氨基酸残基的距离为10.6 Å，无法形成离子键，使得a0螺旋和Loop 6可以互相靠近，这样活性中心就显得更紧凑。在硫酸锂条件下，Loop 12中的组氨酸 276残基在晶格中与附近一个分子的位于b1A折叠的谷氨酸 179残基形成一个氢键(2.7 Å)。而此氢键在硫酸铵条件中不存在。总之，晶格排列的不同使得a0螺旋、Loop 6和Loop 12的构象在硫酸铵结晶条件下与硫酸锂结晶条件下有所不同。

图1 驱动蛋白单体的晶体结构Fig. 1 Crystal Structure of the monomeric kinesin.ADP: blue; Switch I: cyan; Switch II: yellow; P-loop:magenta; the microtubule-binding region: salmon.

表1 晶体衍射和结构精修Table 1 Data collection and refinement statistics

图2 两种结晶条件下驱动蛋白结构的比较Fig. 2 Structural comparison between the two crystallization conditions. (A) The superposition of the crystal structures in the (NH4)2SO4 condition (cyan) and the Li2SO4 condition (magenta). (B) In the (NH4)2SO4 condition, there is a salt bridge between Arg14 and Glu125 in a neighboring molecule. The salt bridge may have a cantilever force to pull the a0 helix away from the nucleotide to open the pocket.

图3 硫酸铵结晶条件下活性中心的分析Fig. 3 Structural analysis in the active site of the (NH4)2SO4 condition. (A) The residual Fo-Fc electron density map shows a tightly bound SO42-. (B) The isomorphous difference map of the SO42- bound state vs. the ADP bound state. There are no changes in the b-phosphate position because the SO42- is there. There is much less electron density in the AMP and Mg2+ positions.

当结晶溶液不包含游离的ADP时，残余Fo-Fc电子云密度图 (Residual Fo-Fc electron density map) 显示，在原先 ADP的b-磷酸的位置，结合着一个硫酸根离子 (图3A)。对只结合硫酸根的晶体和结合 ADP的晶体进行比较，同构差别图(Fobs，SO4– Fobs，ADP) 显示前者晶体的活性中心的b-磷酸位置电子云密度无差别，而其他位置 (包括镁离子和AMP的位置) 电子云密度大大降低 (图3B)。以上结果表明，在硫酸铵条件下，如果没有游离腺苷酸，晶体活性中心只结合了一个硫酸根离子。而在硫酸锂条件下，即使没有游离的腺苷酸，晶体活性中心仍然结合着ADP[5]。这表明，ADP的亲和力在硫酸铵条件下长出的晶体中比在硫酸锂条件下长出的晶体中要小。这可能是在硫酸锂条件下，晶格中一个邻近分子的谷氨酸125位于ADP的右下方 (图4A)。这个谷氨酸残基的OE1原子和OE2原子同ADP中核糖部分的2¢-位羟基分别形成了距离为3.5 Å和3.6 Å的两个氢键。虽然这两个氢键的距离比较远，但谷氨酸125的羧基由于共轭效应具有电负性，因此这两个氢键对ADP的结合力仍然有贡献。而在硫酸铵条件下，由于晶格排列的不同，上述氢键不存在：谷氨酸125的OE1原子同ADP中核糖部分的 2¢-位羟基距离为 6.7 Å，不能形成氢键(图 4B)。

图4 在两种结晶条件下晶格排列的比较Fig. 4 Crystal packing analysis between the two different crystallization conditions. (A) In the Li2SO4 condition,Glu125 in the neighboring molecule is located at the bottom left. The centering molecule: magenta. The neighboring molecule: pink. Glu125 in the neighboring molecule: green. ADP: blue. (B) In the (NH4)2SO4 condition, Glu125 in the neighboring molecule is located at the bottom right. The centering molecule: cyan. The neighboring molecule:light blue. Glu125 in the neighboring molecule, green. ADP: blue.

2.2 结合在活性中心的硫酸离子的去除

虽然在无游离ADP时，新的结晶条件下得到的晶体只有硫酸根离子结合在活性中心，但是ATP的结构类似物AMPPNP仍然不能被浸泡入活性中心。这可能是由于硫酸根离子在P-loop位点结合的强度非常高，不能被AMPPNP取代。为此，一个不含硫酸根的酒石酸钾钠稳定液 (2.0 mol/L 酒石酸钾钠、30% 甘油、120 mmol/L 氯化镁、77 mmol/L Pipes缓冲液) 被用来去除结合在活性中心的硫酸根离子。这种缓冲液含 30%甘油，可以使晶体免遭破坏 (图5)。当硫酸离子被去除后，AMPPNP就被成功地浸泡入晶体的活性中心 (图6A)。

2.3 在不同腺苷酸结合状态下的晶体结构的比较

驱动蛋白晶体经过酒石酸钾钠浸泡去除硫酸离子后，再分别浸泡加入AMPPNP和ADP。对 AMPPNP和 ADP结合状态下的晶体结构重叠比较后发现，这两者的总体结构没有太大的变化：均方根偏差只有 0.34 Å。但是同构差别图(Fobs,AMPPNP– Fobs,ADP)显示 (图 6)，P-loop 中的苏氨酸88残基被AMPPNP中的g-磷酸推开。开关区域Ⅰ(氨基酸序列 200–206) 和开关区域Ⅱ (氨基酸序列 231–236) 被g-磷酸吸引。位于开关区域Ⅰ附近的微管结合区域Ⅰ(MTⅠ，氨基酸序列139–147) 也移向g-磷酸。但是位于开关区域Ⅱ附近的微管结合区域，例如a4螺旋区，没有明显变化。将活性中心的关键氨基酸残基和 AMPPPNP不包括在模型中，对结构精修后得到的残余 Fo-Fc 图 (Residual Fo – Fc map) 显示 (图 7)，开关区域Ⅰ的精氨酸 204残基同谷氨酸200残基形成一个离子键 (3.2 Å)。开关区域Ⅱ的谷氨酸237残基处于无序状态 (Disorder)而不与精氨酸204残基形成离子键。ADP状态下的残余 Fo-Fc图显示，精氨酸 204同谷氨酸200形成离子键 (3.5 Å)。而ADP状态下的谷氨酸 237虽然清晰可见，但是与精氨酸204距离太远 (7.2 Å)，不能形成离子键。

2.4 点突变体E237A的微管结合区域的显著变化

位于开关区域Ⅱ的谷氨酸 237在驱动蛋白中非常保守。以往文献认为谷氨酸 237残基同精氨酸204残基在ATP结合时会形成一个离子键[16-18]。但是，在硫酸铵结晶条件下，驱动蛋白-AMPPNP复合物晶体结构表明，这个离子键并不存在。为了阐明谷氨酸 237的作用，它被突变为丙氨酸 (E237A)。实验表明，鼠脑驱动蛋白突变体E237A的基础ATPase酶活与野生型相比没有显著的变化 (表2)。

图 5 硫酸根离子从酒石酸钾钠稳定液中去除后的效果Fig. 5 Effect of sulfate removal from a tartrate stabilizing solution. Addition of 30% glycerol is important to preserve the crystal quality.

图6 同构差别图(Fobs,AMPPNP – Fobs,ADP)Fig. 6 Isomorphous difference map (Fobs,AMPPNP – Fobs,ADP). (A) Both SwitchⅠand Ⅱ were attracted towards theg-phosphate. However, only the conformational changes in the SwitchⅠwere propagated to the microtubule binding regionⅠ(MTⅠ). (B) The zoom-in map in the catalytically active site. Thr88 in the P-loop was pushed away by theg-phosphate. E237 was disordered.

图7 在AMPPNP和ADP状态下离子键形成的分析Fig. 7 Salt bridge analysis between the AMPPNP state and the ADP state in the tartrate stabilizing solution. (A) In the residual Fo-Fc map of the AMPPNP state, Glu237 is disordered. There is a salt bridge between Glu200 and Arg204. (B)In the residual Fo-Fc map of the ADP state, though E237 is ordered, it is too far away (7.2 Å) to form a salt bridge with Arg204.

表2 驱动蛋白对不同核苷酸的基础水解活性Table 2 Basal ATPase activity for the different nucleotides

图8 微管结合区域Ⅱ在谷氨酸237突变为丙氨酸后的结构差异Fig. 8 Significant changes in the E237A mutant in the microtubule-ding region Ⅱ region. (A) The superposition of the wild type and E237 structures. (B) In E237A, the main chain of A237 rotated 134° to form a H-bond with Thr88. (C)In the wild type crystal obtained from the Li2SO4 condition, Glu237 side chain formed two H-bonds with Thr88 and one salt bridge with Arg204.

E237A与ADP复合物的晶体结构与文献报道的野生型晶体结构 (2kin.pdb) 总体相似 (均方根偏差只有0.68 Å)。但是，在微管结合区域Ⅱ有非常显著的差别 (图 8)：开关区域Ⅱ中的A237以后序列的氨基酸移到不同的位置；Loop 11和Loop 12变得更无序；a4螺旋和a5螺旋转移了 1.2 Å。在野生型晶体中 (Li2SO4条件下)，谷氨酸237残基同P-loop的苏氨酸88形成两个氢键 (2.7 Å和2.8 Å) 以及同开关区域Ⅰ的精氨酸204形成一个离子键 (3.1 Å)。当谷氨酸237被突变为丙氨酸后，其主链旋转了134度，从而与苏氨酸88主链形成一个氢键 (2.7 Å)。为了同这种变化保存一致，在此突变后的微管结合区域Ⅱ (Loop 11、Loop 12、a4折叠和a5折叠) 都发生了显著的变化。精氨酸 204不能同丙氨酸237形成离子键，但是它的残基同谷氨酸200形成了一个离子键 (3.1 Å)。

3 讨论

AMPPNP、ATPgS和 AMPPCP都是常用的ATP结构类似物。ATPgS中连接g-phosphate和b-phosphate的原子和ATP一样，都是氧原子。ATPgS能被驱动蛋白快速水解，晶体结构中最终只包含ADP (表2)。因此，它不是驱动蛋白晶体结构研究中的理想ATP结构类似物。AMPPCP中连接g-phosphate和b-phosphate的是碳原子。碳原子的电负性比氧原子小很多，而且P-C-P键同ATP中的 P-O-P键差别较大。由于这种大的差异，AMPPCP也不是理想的ATP结构类似物。AMPPNP中连接g-phosphate和b-phosphate的氮原子电负性同氧原子接近，而且P-N-P键同ATP中的P-O-P键差别小。因此，AMPPNP是ATP的理想结构类似物[19-20](图9)。

图9 几种ATP结构类似物的比较Fig. 9 Structural comparison among a few ATP analogs.

驱动蛋白晶体在含AMPPNP的酒石酸钾钠稳定液中浸泡后，在活性中心可以清楚地看到g-phosphate (图 7A)，并吸引开关区域Ⅰ和Ⅱ向其靠拢。开关区域Ⅰ和微管结合区域Ⅰ(包括Loop 7、b5和Loop 8a) 通过氢键相连。因此，受开关区域Ⅰ的影响，微管结合区域Ⅰ也移向g-phosphate。微管结合区域Ⅱ(包括 Loop 11、a4折叠、Loop 12和a5折叠) 在开关区域Ⅱ的 C端，但是并没有随之移向g-phosphate。这可能有两种原因：1) Loop 11在无微管结合时是无序(Disordered) 的状态，同开关区域Ⅱ没有氢键等相互作用。因此，开关区域Ⅱ的变化不能直接反应到微管结合区域Ⅱ来。2) AMPPNP是浸泡入晶体活性中心的。微管结合区域Ⅱ由于晶格排列 (Crystal packing) 的原因，同晶格中另外一个分子接触而在一定程度上被“固定”住了。因此，开关区域Ⅱ的变化不能导致微管结合区域Ⅱ的变化。要观察到微管结合区域Ⅱ可能的变化，驱动蛋白和AMPPNP的复合物必须是从头结晶 (De novo crystallization)，而不能用浸泡的方法。但是这个复合物的结晶条件还没有被找到。

驱动蛋白的ATP水解机制有几种可能[21-22]。其中一种直接水解的机制是：g-phosphate活化附近的一个水分子，使其分解为一个质子和一个带负电荷的羟基。这个羟基亲核攻击g-phosphate的磷原子，形成一种过渡型的三角双锥结构 (Trigonal bipyramidal structure)。这个过渡结构降低了水解活化能，从而断裂了g-phosphate和b-phosphate之间的连接，完成水解过程。Parke等在非常规驱动蛋白Eg5的研究成果支持这一理论[23]。但是 Sablin和 Kikkawa等在另一种非常规驱动蛋白 Kif1A的研究结果却不支持这一理论[17,24]。本文对鼠脑驱动蛋白晶体结构的研究中也没有发现相关证据。以上研究都采用晶体的 X-光衍射，不能检测到水解过程中质子的存在。晶体的中子衍射可以检测到氢原子或质子的存在，因此对驱动蛋白水解机理的深入和直接的研究还要用中子衍射的方法。这种方法需要非常大的晶体 (体积大于1 m3)，技术难度非常大[25-26]。它将成为下阶段研究的一个重要内容。

根据以往文献报道，在Li2SO4结晶条件下，鼠脑驱动蛋白同ADP的复合物晶体结构中开关区域Ⅱ的谷氨酸237同开关区域Ⅰ的精氨酸204有离子键 (3.1 Å) 形成[5]。但是在 (NH4)2SO4结晶条件下，这个离子键并不存在。因此，我们推测这个离子键对ATP的水解并没有直接作用。鼠脑驱动蛋白突变体E237A (表2) 和另外两种驱动蛋白Kar3和NCD相应的突变体显示这个保守的谷氨酸被突变为丙氨酸后，基础ATPase酶活没有变化，但是加入微管不能进一步激活ATPase酶活，而且同微管结合区域的亲和力大大加强[27-28]。我们注意到不管是在Li2SO4结晶条件下还是在 (NH4)2SO4结晶条件下，驱动蛋白同ADP复合物晶体结构中，谷氨酸237残基同P-loop中苏氨酸88形成氢键。而在驱动蛋白同 AMPPNP复合物晶体结构中，g-phosphate将苏氨酸88推开，谷氨酸237变得无序而不能同苏氨酸88形成氢键。这种变化可能使得谷氨酸 237之后的微管结合区更好地同微管结合。E237A晶体结构表明，当上述氢键被破坏后，丙氨酸 237主链发生扭转，从而使得微管结合区域也随之发生显著变化。类似的结构变化在 kif1A·AMPPCP复合物的晶体结构中也存在[18]。这些变化可能使得驱动蛋白同微管的亲和力增强。在ATP被水解为ADP和磷酸后，新的ATP分子取代原来的水解产物的整个过程中，ADP的释放是整个过程的限速步骤，而微管可以大大加速 ADP的释放，从而提高ATPase的总体酶活[29-30]。微管结合到驱动蛋白后，开关区域Ⅱ发生显著变化，从而导致 P-loop无序而不能紧密结合ADP[31]。ADP中b-phosphate和P-loop的紧密结合是ADP结合力中最重要的部分。当谷氨酸 237被突变为丙氨酸后，原来谷氨酸237残基同苏氨酸88之间的氢键作用不复存在，这样开关区域Ⅱ的变化不能被传递到P-loop，ADP被“锁住”而不容易释放，这导致微管不能刺激ADP的释放。总之，开关区域Ⅱ的谷氨酸起着联系活性中心和微管结合区域的作用：ATP中g-phosphate的存在使得开关区域Ⅱ将信号传递到微管结合区域，使得驱动蛋白同微管的亲和力增加。当ATP水解为ADP后，微管的结合信号通过开关区域Ⅱ传递回活性中心，刺激ADP的释放，加速了新的ATP分子的结合。

致谢：感谢上海同步辐射光源 (SSRF) 光束线BL17U1的工作人员在本课题数据搜集和处理时给予的大力支持。

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