提高成纤维细胞生长因子-21产率和纯度

于丹，叶贤龙，任桂萍，徐鹏飞，厉书杰，牛泽杉，李德山

东北农业大学生命科学学院 生物制药教研室，黑龙江 哈尔滨 150030

成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)是成纤维细胞因子家族的新成员[1]，具有不依赖胰岛素调节糖脂代谢[2]，改善胰岛素抵抗，提高靶组织对胰岛素敏感性等多种代谢调控功能，不会导致低血糖、水肿、过敏等毒副作用[3]。FGF-21在糖尿病临床应用方面具有很大的潜力，给糖尿病患者带来新希望[4]。

大肠杆菌以包涵体形式表达外源蛋白，具有表达量及纯度高的突出优点，而可溶形式表达目的蛋白不仅产量低，而且上清中含有大量宿主细胞染色体翻译表达的杂质蛋白，纯化工艺复杂[5-6]。目前，科研人员却仍以大肠杆菌表达可溶形式FGF-21，这是因为FGF-21蛋白本身结构与性质使其表达量及复性率降低[1-7]，复性后蛋白活性减弱甚至丧失。科研人员曾用多种表达载体及优化各种方法以包涵体形式表达FGF-21，但均未能解决上述问题。

本实验采用SUMO表达载体首次以包涵体形式表达hFGF-21，突破了传统包涵体离心洗涤，人工变复性的复杂生产工艺，将中空纤维柱膜过滤技术应用于包涵体形式蛋白的整个生产过程中。最终，90%以上SUMO-hFGF-21形成包涵体，其表达量约为可溶性表达的3倍；由于复性条件温和及作为分子伴侣的SUMO标签促进了蛋白质的正确折叠[8]，使hFGF-21复性率显著提高，获得的ihFGF-21生物学活性较shFGF-21无显著差异，为hFGF-21由实验室向中试及产业化生产提供了更经济、更高效的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 工程菌

携带pSUMO-hFGF-21质粒的工程菌由东北农业大学生物制药教研室提供。

1.1.2 试剂

异丙基硫代β-D-半乳糖苷 (IPTG)、溶菌酶、氨苄青霉素 (Amp)购自TaKaRa公司。葡萄糖检测试剂盒购自北京金豪制药股份有限公司。Quixstand膜处理系统，750 kDa和10 kDa中空纤维柱，AKTATMpurifier100系统，Ni Sepharose 6 FF及HiPrep 26/10 Desalting均购自GE公司。

1.1.3 实验细胞及动物

HepG2细胞为东北农业大学生物制药教研室提供。db/db小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号SCXK(沪)2013-0002。

1.2 方法

1.2.1 人成纤维细胞生长因子-21融合蛋白(iSUMO-hFGF-21)的包涵体表达

取保存于–80℃的携带pSUMO-hFGF-21质粒的工程菌，在含有氨苄青霉素 (100 U/mL)的TB固体培养基上划线，37℃培养过夜;挑取单菌落，接种于20 mL TB培养基中，37℃培养10 h后，以1∶100的比例接种于500mL含氨苄青霉素(100 U/mL)TB培养基中，37℃培养约3.5 h，A600=0.6–0.8时，加入IPTG至终浓度为 0.25mmol/L，37℃诱导4 h后，4 000 r/min离心30 min收集菌体，15%SDS-PAGE鉴定表达量。

1.2.2 iSUMO-hFGF-21包涵体的提取、洗涤、变性及复性

将收集的菌体按1 g/10 mL的比例悬浮于平衡缓冲液 (40 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.4)中，加入终浓度为1 mg/mL的溶菌酶，冰上放置1 h，超声波破碎菌体细胞 (工作 1 s，间隔 1 s，4 min/次，共 3 次)。

用750 kDa中空纤维柱超滤膜富集包涵体，弃去渗透端流出液体。当总体积约为50 mL时，加入 200 mL洗涤液 (20 mmol/L Na3PO4，2 mol/L尿素，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)洗涤包涵体，当溶液体积为50 mL，再向其中加入洗涤液至200 mL。重复上述实验4次。

在750 kDa的中空纤维柱超滤膜中，关闭渗透端，向洗涤后的包涵体中加入200 mL的变性液 (20 mmol/L Na3PO4，8 mol/L Urea，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)，循环变性2 h。完全变性后，打开渗透端，渗透端收集液即为iSUMO-hFGF-21变性液。用10 kDa中空纤维柱对变性后的iSUMO-hFGF-21进行复性：将盛有复性液的三角瓶 (20 mmol/L Na3PO4，150 mmol/L NaCl，pH 8.0)用胶皮管与中空纤维柱的储液器连接。向储液器中加入变性液后，打开透过端，由于储存器中产生负压，使复性液以一定的速度滴加至变性液中，缓慢复性。当加入复性液总体积为变性液体积20倍时，8 000 r/min、4℃离心20 min，收集上清，即完成iSUMO-hFGF-21的复性。

1.2.3 ihFGF-21的纯化

用平衡缓冲液(40 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.4)平衡 Ni Sepharose 6 FF亲和层析柱5个柱体积后，上样。再用平衡缓冲液洗去非特异性吸附的杂质蛋白，洗脱液 (500 mmol/L咪唑，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Na3PO4，pH 7.4)洗脱融合蛋白iSUMO-hFGF-21，收集洗脱峰。经Sephadex G-25脱盐柱将iSUMO-hFGF-21置换到磷酸盐缓冲溶液 (50 mmol/L Na3PO4，150 mmol/L NaCl，pH 7.0)中，加入SUMO 蛋白酶I至终浓度为2 mmol/L，4℃酶切过夜[9]。再经Ni Sepharose 6 FF亲和层析，收集流穿液，15%SDS-PAGE电泳检测目的蛋白ihFGF-21的产量及纯度。

1.2.4 shFGF-21的表达与纯化

将携带重组质粒 pSUMO-hFGF-21的工程菌，划线培养；单菌落接种至20 mL含氨苄青霉素 (100 U/mL)LB培养基中，37℃培养10 h，按1%的比例接种于500 mL/瓶含氨苄青霉素(100 U/mL)LB培养基三角瓶中，37℃培养2.5 h，A600=0.3–0.4时，加入IPTG至浓度为0.25 mmol/L进行诱导，4 h后4 000 r/min、4℃离心30 min，以1 g/10 mL的比例重悬菌体，放置–20℃保存；待收集上述菌体20 L后，超声波破碎；破碎完全后4 000 r/min、4℃离心30 min。shFGF-21纯化策略，产量和纯度检验方法与上述ihFGF-21相同。

1.2.5 免疫印迹法检测ihFGF-21

以shFGF-21作为阳性对照，BSA作为阴性对照，将纯化的产物进行15%SDS-PAGE电泳然后转至硝酸纤维素膜上。转膜完成后，经5%脱脂奶粉-PBS-0.05%Tween 20室温封闭2 h，与兔抗人FGF-21单抗反应12 h，PBS洗涤5次，每次5 min。再与HRP偶联的羊抗兔二抗室温反应2 h，洗涤后加入发光底物DAB避光显影。

1.2.6 ihFGF-21与shFGF-21细胞水平上生物学活性的比较

利用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法(GOD-POD)[10]检测hFGF-21促进细胞糖吸收的生物学作用。HepG2细胞饥饿12 h后，分别用10、100及 1 000 nmol/L的ihmFGF21蛋白和shFGF21蛋白刺激细胞 24 h；在24 h时，分别取培养上清液2 μL，加入到200 μL葡萄糖检测液中，37℃反应5–10 min，在490 nm波长下检测其OD值。每孔重复3次，按公式计算细胞对葡萄糖的消耗率并运用SPSS软件分析实验结果，两组间数据比较采用t检验。

计算培养液中残留的葡萄糖的浓度，公式为：

葡萄糖浓度 (mmol/L)=OD样品/OD标准×5.55 mmol/L。

计算细胞对葡萄糖的消耗率，公式为：

细胞葡萄糖消耗率 (%)=[(C空白葡萄糖–C给药葡萄糖)/C空白葡萄糖]×100%。

1.2.7 ihFGF-21与shFGF-21调节2型糖尿病模型db/db鼠短期与长期生物学活性的比较

将成模的db/db小鼠随机分为 3组，每组5只。通过皮下注射的方式，给予各实验组相应的蛋白1次，剂量0.5 mg/kg，模型对照组注射相同体积的生理盐水，给药3 h后，尾静脉取血检测血糖浓度，比较两种蛋白调节模型小鼠血糖的短期降糖效果。每天早上8点给药，连续注射16 d，每两天检测各处理组小鼠的血糖1次，停药后继续观察小鼠血糖3 d，观察两种蛋白的长期降糖活性的差异。

2 结果与分析

2.1 iSUMO-hFGF-21与sSUMO-hFGF-21的表达量分析

取3 mL菌液，离心、破碎完全后，15%SDS-PAGE电泳比较iSUMO-hFGF-21与sSUMO-hFGF-21的表达量，根据凝胶成像灰度分析软件分析表明，iSUMO-hFGF-21的表达量约是sSUMO-hFGF-21的3倍，结果如图1所示。

2.2 iSUMO-hFGF-21包涵体的提取、洗涤、变性及复性

菌体破碎完全后，应用中空纤维柱对包涵体进行洗涤，除去部分杂质蛋白、脂质、核酸等。重复洗涤3次后，溶解包涵体，当溶液呈棕黄色、透明状态时，打开渗透端，收集渗透端流出液即为完全变性的iSUMO-hFGF-21。用10 kDa中空纤维柱对融合蛋白iSUMO-hFGF-21进行复性后，8 000 r/min、4℃离心20 min，收集上清。经SDS-PAGE分析可知，洗涤及复性过程中iSUMO-hFGF-21几乎无损失，且洗涤后iSUMO-hFGF-21包涵体的纯度为73%，说明应用中空纤维柱膜过滤技术，不仅提高了蛋白的收率，而且提高目的蛋白的纯度，结果如图2所示。

2.3 ihFGF-21的纯化

图2 SDS-PAGE分析iSUMO-hFGF-21的纯度Fig.2 Purity analysis of the iSUMO-hFGF-21 protein by SDS-PAGE.M:the relative molecular mass of standard proteins;1:iSUMO-hFGF-21 before washing(20 μL);2：iSUMO-hFGF-21before washing(10 μL);3:iSUMO-hFGF-21 afterwashing;4:supernatantof iSUMO-hFGF-21 after denaturing;5:supernatant of iSUMO-hFGF-21 after refolding.

图3 iSUMO-hFGF-21亲和层析纯化结果Fig. 3 Affinity chromatography result of iSUMO-hFGF-21.

结果显示，经过Ni Sepharose FF亲和层析(图3)，Sephadex G-25脱盐，酶切以及再次应用亲和层析 (图4)后，收集流穿液即为成熟的ihFGF-21，15%SDS-PAGE电泳检测目的蛋白hFGF-21的浓度及纯度。根据凝胶成像分析软件灰度分析表明，ihFGF-21的纯度约为95%以上，最终收率约为20 mg/L(图5)。

2.4 shFGF-21的表达与纯化

结果显示，经过Ni Sepharose FF亲和层析(图6)，Sephadex G-25脱盐，酶切以及再次亲和层析后，收集流穿液即为成熟的ihFGF-21，15%SDS-PAGE电泳检测hFGF-21的浓度及纯度。根据凝胶成像分析软件灰度分析表明，shFGF-21纯度为90%，总的表达量为6 mg/L(图7)。

图4 ihFGF-21亲和层析纯化结果Fig.4 Affinity chromatography result of ihFGF-21.

图5 iSUMO-hFGF-21和ihFGF-21纯化后蛋白表达量与纯度分析Fig.5 Yield and purity analysis of the ihFGF-21 protein after purification.M:the relative molecular mass of standard proteins;1:iSUMO-hFGF-21 protein;2,3:mature ihFGF-21 after enzyme digestion and purification.

2.5 ihFGF-21与shFGF-21免疫印迹比较理化性质的差异

图7 SDS-PAGE分析纯化后shFGF-21的收率及纯度Fig.7 Yield and purity analysis of the shFGF-21 protein after purification.M:the relative molecular mass of standard proteins;1:mature shFGF-21.

经Anti-ihFGF-21单抗的免疫印迹实验(其中BSA为阴性对照，shFGF-21为阳性对照)，硝酸纤维素膜上，阴性对照BSA泳道为空白，阳性对照shFGF-21与实验组ihFGF-21均出现单一条带 (图8)，证明纯化的目的蛋白为成纤维细胞生长因子-21。

2.6 ihFGF-21与shFGF-21细胞水平上生物学活性的比较

结果如图9所示，经过10、100、1000 nmol/L shFGF-21与ihFGF-21分别刺激后的细胞，采用GOD-POD法检测其葡萄糖吸收率；实验结果表明，与空白对照组相比，两者均能显著增加细胞葡萄糖吸收率，且呈剂量依赖性；不同浓度的shFGF-21与ihFGF-21促进细胞糖吸收的生物学活性无显著差异 (P=0.563>0.05)，说明ihFGF-21与shFGF-21细胞水平上促进HepG2细胞糖吸收的生物学活性并没有显著差异，证明了采用中空纤维柱提取包涵体形式表达的FGF-21时，并没有降低蛋白的生物学活性，此种提取工艺可行。

2.7 ihFGF-21与shFGF-21对db/db糖尿病模型鼠的短期降糖生物学活性的比较

注射前后，注射生理盐水的模型对照组血糖没有变化；注射3 h后，模型对照组的血糖由(16.02±4.29)mmol/L 升至(16.18±1.79)mmol/L，shFGF-21组血糖由(15.92±4.301)mmol/L降至(10.02±3.43)mmol/L，ihFGF-21 组 血 糖 由(16.15±3.67)mmol/L 降至(10.00±1.59)mmol/L。与模型对照组相比，无论作用效果还是作用时间，两种途径获得的成熟蛋白都表现出了良好的降糖效果，血糖在注射1 h开始下降，注射3 h降糖效果较模型对照组相比差异极显著，shFGF-21组与ihFGF-21组差异不显著，结果如图10所示。

2.8 ihFGF-21与shFGF-21对db/db糖尿病模型鼠的长期降糖生物学活性的比较

连续注射16 d后，检测血糖。在长期调节2型糖尿病模型db/db鼠血糖的生物学功能上，与模型对照组相比，ihFGF-21与shFGF-21均表现出了显著的差异，但两者之间无显著差异；两者均能长期持续的调节2型糖尿病模型db/db鼠的血糖，停止注射3 d后，均恢复至与模型对照组相同的血糖水平 (图11)。说明此法可以保证获得的ihFGF-21的生物学活性，是提取hFGF-21的有效方法。

图8 ihFGF-21与shFGF-21免疫印迹比较理化性质差异的分析Fig.8 Physical properties analysis of the difference between the ihFGF-21 and shFGF-21 proteins.1:mature ihFGF-21;2:mature shFGF-21;3:BSA;M:the relative molecular mass of standard proteins.

图10 ihFGF-21与shFGF-2对db/db糖尿病模型鼠的短期降糖效果的比较Fig.10 Comparation of ihFGF-21and shFGF-21 on short-term hypoglycemic effect.The db/db mice were treated with 0.5 mg/kg shFGF-21 or ihFGF-21.The blood glucose level of the model mice were examined at 0 h and 3 h.The valuesshown are the average of 6 independent measurements.**P<0.01 vs control.

图11 ihFGF-21与shFGF-21对db/db糖尿病模型鼠的长期降糖生物学活性的比较Fig.11 Comparation of ihFGF-21 and shFGF-21 on long-term hypoglycemic effect.The db/db mice were administrated once a day with saline (control),0.5 mg/kg shFGF-21 or ihFGF-21 for 16 d.The blood glucose level of db/db mice were examined before injection each day at 8 am.The valuesshown are the average of 6 independent measurements.

3 讨论

近年来，随着人们对成纤维细胞生长因子-21(FGF-21)结构和功能的深入研究， FGF-21安全、可靠，不依赖胰岛素单独调节糖脂代谢，改善胰岛素抵抗，无副作用的报道，使其成为治疗糖尿病、肥胖、脂肪肝等代谢疾病的潜力药[11-12]。目前，FGF-21的生产已经逐渐由实验室向中试规模转变，开发高效、高纯度的FGF-21的生产工艺，成为科研人员共同关注的焦点。

尽管大肠杆菌在表达外源基因方面有众多的优点，但是外源基因的高效表达[13]，除受到其本身性质影响外，还与表达系统的特性及其他因素密切相关。本研究通过优化本实验室构建的携带pSUMO-hFGF-21质粒工程菌的培养条件，采用TB培养基，150 r/min摇瓶培养，当菌体生长至A600=0.6–0.8时进行诱导，37℃诱导表达4 h，90%以上的SUMO-hFGF-21以包涵体形式表达，其表达量为可溶性表达表达量的3倍。这是由于采用包涵体形式表达FGF-21时，诱导温度及转速的升高提高了细胞内相关酶的活性，增加了溶氧；菌体浓度的增加，提高了蛋白的表达量；蛋白表达过快，无法快速正确折叠，从而形成包涵体[14]。包涵体形式表达FGF-21，提高了蛋白表达量，降低了生产成本，有利于规模化生产。

如何对包涵体蛋白质进行体外高效复性是基因工程技术面临的一个重要难题。传统方法提取包涵体蛋白，不仅工艺复杂，生产周期长，而且复性率低，蛋白损失严重，复性后蛋白活性降低甚至无活性。而应用中空纤维柱膜过滤技术提取包涵体途径纯化表达的hFGF-21，显著提高了蛋白的复性率。这可能是因为中空纤维柱复性过程中，将复性液缓慢加入变性液中，以缓慢的速度除去变性剂；变性剂除了能溶解包涵体使其去折叠外，在复性过程中还可以有效地抑制复性中间体相互聚集，从而增加复性率[15]。

本实验从包涵体富集到复性，都采用中空纤维柱膜过滤技术，充分发挥了其处理量大、处理能力持久的优势。与传统的离心方法相比，应用中空纤维柱对包涵体进行洗涤使生产周期缩短了1/3，且有效降低蛋白损失；大部分杂蛋白、脂类等杂质可透过膜孔，使包涵体洗涤更加彻底；循环变性2 h后，直接对变性液进行澄清，然后利用密闭储藏器内产生的负压缓慢加入复性液，缓慢进行稀释复性，保证了温和的复性条件，有利于提高FGF-21的正确折叠效率，最后通过离心获得初级纯化后的蛋白溶液。整个过程都在4℃展示柜中进行，低温环境，有利于FGF-21的正确折叠[16]。经SDS-PAGE分析结果表明，iSUMO-hFGF-21的纯度显著高于sSUMO-hFGF-21，此法除去了多数非特异性吸附在层析介质上的杂质蛋白，简化了纯化工艺。

除此之外，本法获得的成熟FGF-21的活性与可溶性表达获得的FGF-21无显著差别。通过免疫印迹法，证明所获得的是hFGF-21。在细胞实验中，两者均可促进葡萄糖的吸收，且与空白对照组相比，差异显著；在动物实验中，两种途径获得的FGF-21在短期药效实验中，均在注射1 h起作用，注射3 h血糖明显降低；长期药效实验中，连续注射均可使模型动物的血糖降至正常水平，且降糖效果无明显差异，说明以包涵体途径可保证FGF-21的生物学活性。分析原因可能有以下两点：第一，作为分子伴侣的SUMO标签可以增强外源蛋白质抗蛋白酶水解，显著增加重组蛋白表达量[17]，促进靶蛋白正确折叠，提高可溶性[18-19]等功能[20-23]；SUMO标签的存在能使靶蛋白维持在具有折叠能力的状态并使它们进行正确重折叠，同时能有效地保留靶蛋白质聚集体中天然结构；其机理可能是由于SUMO标签作为一个高度疏水的核心为目的蛋白的折叠提供成核位点，减少了蛋白之间的相互作用，使其正确折叠，最终增加了融合蛋白的可溶性[24]；第二，采用中空纤维柱操作，条件温和，有利于蛋白质的正确折叠，操作简单，耗时短，避免了因长期暴露室温导致蛋白活性下降。

中空纤维柱膜过滤技术，现已被广泛用于菌体、细胞等的富集，菌液的澄清，缓冲液置换、蛋白浓缩等方面[25]。本实验采用中空纤维柱膜过滤技术对ihFGF-21进行变复性，与shFGF-21相比较，生物活性上无显著差异，使其在生命科学的领域中又有了新的应用价值，为FGF-21的大规模生产提供了更实用、更高效的工艺。

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