延胡索总生物碱提取工艺的实验研究

施婷婷，王建新，李希,3

·炮制制剂·

延胡索总生物碱提取工艺的实验研究

施婷婷1，王建新2，李希1,3

目的：筛选延胡索总生物碱的最佳提取工艺。方法：按正交试验表提取，利用生物碱易溶于酸水难溶于碱水的特点对提取物纯化，采用紫外分光光度法测定总生物碱含量，以延胡索总生物碱含量及干膏率为检测指标，确定最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺为：8倍量60%乙醇，提取3次，2h/次。结论：该工艺提取率高，稳定性好，为延胡索总生物碱的进一步药理作用研究提供参考。

延胡索；生物碱；干膏率；正交试验

延胡索为罂粟科植物Corydalis yanhusuo W.T.Wang的干燥根茎[1]，味辛、苦，性温，入心、肝、脾经。其主要化学成分为生物碱，既能入血分而活血化瘀，又能走气分而行气止痛，为血中之气药，止痛之佳品。现代研究表明延胡索总生物碱不仅具有止痛的作用，还具有抗胃溃疡、镇静、催眠、降压、抗心肌缺血和心律失常以及抗肿瘤等[2]广泛的药理作用；本实验利用生物碱易溶于酸水难溶于碱水的特点对提取物纯化，以总生物碱的含量及干膏率为指标，采用正交试验设计法，优选最佳提取工艺，为延胡索总生物碱的进一步药理作用研究奠定基础。

1 仪器与材料

752型紫外可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；DJ-04型粉碎机（上海淀久中药机械制造有限公司）；京制0000249号电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；DRT-TW型调温电热套（郑州长城科工贸有限公司）；DZF系列真空干燥箱（上海华联医疗器械有限公司）；KUDOS SK5200LH超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；DK-S24型电热恒温水浴锅（上海华联医疗器械有限公司）；延胡索药材（批号：131028）购自上海德华国药制品有限公司，经鉴定与2010版药典一部正品相符；延胡索乙素对照品（中国药品生物制品检定所，批号110726-201213）；95%乙醇（上海振兴化工一厂）；纯化水（自制）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总生物碱含量测定方法

2.1.1 溶液的制备

对照品溶液的制备 精密称取延胡索乙素对照品适量，加无水乙醇制成每1mL含延胡索乙素80 µg的对照品溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备 将5 g药材提取物浓缩定容至50 mL，精密吸取提取液5 mL置于蒸发皿中，水浴蒸尽乙醇，5 mL水转移至分液漏斗中，HCL酸化至pH=2，氯仿（10 mL,10mL）萃取2次，取水层加氨水碱化调pH至10-11，氯仿萃取3次（10 mL,10 mL, 10 mL）,合并氯仿萃取液，用水5 mL洗一次，水浴蒸干挥尽氯仿，无水乙醇定容至25 mL，过滤取续滤液1 mL无水乙醇定容至10 mL，摇匀，即得。

2.1.2 波长选择 取延胡索乙素对照品及延胡索提取物干膏适量，无水乙醇溶解，以无水乙醇为空白参比溶液，在200-400 nm范围内波长扫描，结果表明二者均在282 nm处有最大吸收峰，故本实验选282 nm为最佳检测波长。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密吸取上述对照品溶液1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，置于10 mL容量瓶中，无水乙醇定容，282 nm波长处测定吸光度；以延胡索乙素的浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：Y=13.874X+0.0045(r2=0.9999，n=5)。结果表明：延胡索乙素在8 µg﹒mL-1～40 µg﹒mL-1范围内吸光度与浓度的线性关系良好。

2.1.4 精密度 取3.2 µg﹒mL-1延胡索乙素对照品溶液，在同一条件下连续测定7次，RSD%=1.28%（n=7），结果表明方法精密度良好。

2.1.5 重复性 精密称取延胡索药材粗粉6份，每份5 g，正交试验5组条件（8倍60%乙醇提取2次，每次2 h），平行制备6组提取液，浓缩定容至50 mL，282 nm波长处测定吸光度，RSD%=1.27%（n=6），结果表明实验重复性良好。

2.1.6 稳定性 取延胡索提取物干膏适量，5 mL水转移至分液漏斗中，按“2.1.1”项下供试品方法处理，282 nm波长处24 h内（0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h）测定吸光度，RSD%=2.05%（n=6），表明药物在24 h内基本稳定。

2.1.7 加样回收 精密称取6份已知含量样品干膏10.7 mg，其中含有1.2 mg生物碱（总生物碱以延胡索乙素计），分别加入对照品0.816 mg，按照供试品方法处理后，在282 nm处测定吸光度，平均加样回收率102.497%，RSD%=2.64%（n=6），结果表明回收率良好。

2.1.8 总生物碱含量测定 分别取“3.1”项下得到的9组供试品溶液，按“2.1.1”项下供试品方法处理，282 nm波长处测定吸光度。

2.2 干膏率的测定

精密吸取各组提取液10 mL，分别置于已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置真空干燥箱（60℃）干燥至恒重，置于干燥器中放置30 min，取出，称重，计算干膏率。

3 正交试验

3.1 总生物碱乙醇提取工艺研究

取延胡索药材粗粉9份，以乙醇为提取溶剂，在文献资料[3～5]及与预实验结果基础上选择不同提取时间、提取次数、不同浓度的乙醇、溶剂倍数（表1），按正交试验表进行提取，得9份样品溶液，备用。

表1 正交试验因素水平表

3.2 正交试验及结果

以延胡索总生物碱、干膏率为指标，进行L9(34)正交试验，采用中医药统计软件进行数据处理分析，结果见表2、表3 。

表2 正交试验总生物碱直观分析结果

表3 正交试验方差分析结果

3.3 结果分析

正交试验方差分析结果显示，因素A（提取次数）为主要影响因素，影响因素的主次顺序A＞C＞D＞B，综合表2、表3，确定提取条件的优化组合为：A3B2C3D1，即8倍60%乙醇，提取3次，每次2 h。

3.4 提取工艺验证

由于优选结果在正交试验表中未出现，为检验其可行性，故进行验证试验；称取延胡索药材粗粉50g，共3份，选用上述优化提取工艺进行提取，按“2.1”、“2.2”方法进行测定；三份验证工艺结果总生物碱含量分别为12.004 mg﹒g-1、11.610 mg﹒g-1、12.283 mg﹒g-1，平均总生物碱含量为11.966 mg﹒g-1，干膏率分别为12.317%、12.611%、13.01%，平均干膏率为12.646%，表明优化结果合理，稳定可行。

4 讨论

在建立延胡索总生物碱含量测定方法时，考虑到单以总生物碱的含量为考察指标结果不够全面，为保证实验结果准确性，本实验以浸膏率为另一个考察指标。在延胡索总生物碱含量测定方法的选择过程中，本实验对酸碱滴定法[6]进行详细考察，结果发现实验结果偏差较大，重现性差，分析结果可能是由色素干扰，读数误差等造成；HPLC法对中药材有效成分含量测定误差小，准确度高，但存在耗时耗力，对色谱柱损害性大等缺点，综合考虑下采用紫外分光光度法进行总生物碱测定，简单，快捷。

在用紫外分光光度法测定总生物碱含量时，为防止色素成分干扰试验结果，故对总生物碱进行初步纯化后测定；在对文献[7]中采用的中性氧化铝柱考察时发现，纯化速度慢，时间较长；本实验利用生物碱成分易溶于酸水难溶于碱水的特点对提取物进行纯化，使延胡索总生物碱成分得以大量富集后进行紫外含量测定，速度快，结果较好。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:94.

[2] 石俊敏,韩伟立,叶文才,等.延胡索的化学成分研究[J].天然产物研究与开发,2011,23(4):647.

[3] 卢耀文,杨中林.延胡索乙素提取工艺优选研究[J].中成药,2008,30(8):1247.

[4] 乔立俊.延胡索有效成分提取工艺研究[J].中药制剂工程与技术,2009,10(6):23.

[5] 侯晓琳,石光,王新闻,等.延胡索总生物碱的提取纯化实验研究[J].中国中医药现代远程教育,2013,11(12):154.

[6] 黄红英,张建华,董钰明.延胡索与不同药物配伍中总生物碱含量的测定[J].四川中医,2007,25(12):46.

[7] 吕子明,刘丹,刘文娟,等.正交试验优选延胡索总生物碱的提取工艺[J].中国保健营养,2012,2:103.

（责任编辑：李芸霞）

Study on total alkaloids extraction process of Rhizoma corydalis

SHI Ting-ting1, WANG Jian-xin2, LI Xi3//(1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610072;2.School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai 201203;3. Sichuan Province Chinese Academy of Sciences institute of Medicine ,Chengdu 610031,Sichuan)

Objective:To choose the best extraction technology of Rhizoma corydalis.Method:According to the orthogonal test table and the characteristics of the alkaloids easy to soluble in acid to extract and purify the total alkaloids. In order to determine the best extraction conditions, the spectrophotometry was chosen to measure the total alkaloid content of the Rhizoma corydalis. And the total alkaloids content and extraction rate were selected as examine factors.Result:The best extraction conditions was as following: eight times 60% ethanol, 3 times, 2 h each time.Conclusion:The extraction effciency is high and stability, which can provide a reference for the further pharmacological effects research of Rhizoma corydalis total alkaloids.

Rhizoma corydalis; total alkaloids; dry extract yield; orthogonal test

R 932

A

1674-926X(2014)03-005-03

1.成都中医药大学，四川 成都 610072；2.复旦大学药学院，上海 201203；3.四川省中医药科学院中医研究所，四川 成都 610031

施婷婷，女（1989-），在读硕士研究生，主要从事中药新制剂、新剂型及中药新技术方向研究Tel:15221151751 Email:874283948@qq.com

2014-03-03