丹参和氢化可的松对重症急性胰腺炎大鼠三磷酸肌醇及钙代谢的影响

王行，石承先

·药理毒理·

丹参和氢化可的松对重症急性胰腺炎大鼠三磷酸肌醇及钙代谢的影响

王行1，石承先2

目的：观察重症急性胰腺炎(SAP)动物模型三磷酸肌醇（IP3）的变化及与钙代谢的关系和丹参及糖皮质激素的影响。方法：50只SD大鼠随机分5组：SAP模型组（SAP组）、丹参治疗组（A组）、氢化可的松治疗组（B组）、丹参加氢化可的松治疗组（AB组）和对照组(C组)，各10只。SAP组逆行胰胆管注射3%牛磺胆酸钠建立SAP模型, C组则注射生理盐水（NS）。SAP组和C组术后行阴茎背静脉注射NS；A组、B组和AB组如SAP组一样建立模型，术后分别注射丹参、氢化可的松、丹参加氢化可的松。18 h后，观察各组胰腺细胞IP3和细胞内钙（Ca2+）、血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、血清钙（血钙）和淀粉酶（AMY），以及胰腺的病理改变。结果：SAP组IP3、Ca2+、TNF-α、AMY和胰腺病理评分（PSP）显著高于A组、B组、AB组和C组（p＜0.05)，其中AB组明显低于A组和B组（p＜0.05)，但A、B组间无明显差异（p＞0.05）；C组的PSP明显低于A组、B组和AB组（p＜0.05)，C组的IP3和Ca2+明显低于AB组（p＜0.05)，AB组与C组的TNF-α间无明显差异（p＞0.05）；IP3与Ca2+，IP3与TNF-α间呈明显正相关（r分别为0.987和0.937，p＜0.05)；血钙则是SAP组显著低于A组、B组、AB组和C组（p＜0.05)， AB组和C组分别明显高于A组和B组（p＜0.05），AB组显著低于C组（p＜0.05），但A组与B组间无明显差别（p＞0.05）。IP3、Ca2+和TNF-α与血钙为负相关（r分别为-0.997、-0.980和-0.915，p＜0.05)。结论：SAP大鼠胰腺细胞IP3显著升高； IP3与Ca2+和TNF-α水平呈明显正相关，前三者与血钙呈负相关， IP3可能是引起细胞内外钙和TNF-α变化的重要原因之一；丹参和糖皮质激素均可抑制SAP大鼠胰腺细胞IP3和Ca2+及TNF-α的释放，促进血钙水平回升，胰腺组织病理损害减轻，联合使用丹参和氢化可的松具有协同作用。

重症急性胰腺炎；三磷酸肌醇；细胞内钙；丹参；糖皮质激素

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一种临床常见的急腹症，约25%的AP会发展为重型急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）[1]。SAP发展迅速，并发症多，死亡率高[2]。在SAP的早期和感染期，由SAP及其感染诱发的细胞因子瀑布样释放导致的重要器官损伤是SAP死亡的主要原因[2～3]。观察发现，SAP时存在钙超载，钙超载可激活核因子-κβ及相关的炎症因子，引起胰腺坏死[4～5]。1，4，5三磷酸肌醇（inositol 1 ,4 ,5- trisphosphate,IP3）是细胞内的第二信使，对细胞内钙调控起着重要的作用[6]。丹参和糖皮质激素均用于治疗SAP。然而SAP患者的IP3有何变化及其与钙代谢的关系，以及丹参和糖皮质激素对这些变化有何影响，尚不清楚。本研究通过建立SAP动物模型，观察SAP时胰腺细胞IP3的变化及其与钙代谢的关系，以及丹参和糖皮质激素的影响，从细胞信号通路方面探讨SAP发病及治疗的机制。

1 材料与实验动物

实验动物：清洁级健康成年雄性SD大鼠50只，体重为200～250 g（购自第三军医大学实验动物中心）。

试药：牛磺胆酸（购自美国Sigma公司）；丹参注射液与氢化可的松（均购自贵州省人民医院）；三磷酸肌醇ELISA试剂盒（北京尚柏生物有限公司）、AM Ester试剂盒（北京博雷德生物有限公司）、TNF-α ELISA试剂盒（重庆晶美生物工程有限公司）。

2 方法与结果

采用抓阄的方式将50只大鼠随机分为5组： SAP模型组（SAP组）、丹参治疗组（A组）、氢化可的松治疗组（ B组）、丹参加氢化可的松治疗组（AB组）和对照组（C组）。每组10只。

2.2 实验动物的处理

2.2.1 制模 各组动物于实验前12 h禁食，自由饮水。采用乙醚持续吸入麻醉，按常规无菌方法作上腹正中切口入腹，参照Aho等[7]方法并改进复制SAP大鼠模型[8]。SAP组在开腹后用无创血管夹夹闭肝门部胆管，在相当于胆胰管开口处对侧肠壁无血管区，用4.5号针穿刺肠壁，通过肠腔后逆行穿刺入胆胰管内1 cm, 以拇、食指压迫封闭胰胆管远端并固定穿刺针，推注3%牛磺胆酸1 mL﹒kg-1, 推注速度为0.2 mL﹒min-1，压力约20 cmH2O，术中即可见胰腺从胰管周围开始充血、水肿。保持压力并防止药液逆流10 min后退出穿刺针，撤除肝门部血管夹，以5-0丝线缝扎关闭穿刺孔，逐层关腹完成建模；C组为按上述方法向胆胰管内逆行推注NS完成建模。

2.2.2 给药 建模成功后，SAP组和C组关腹后立刻行阴茎背静脉推注生理盐水（normal sodium，NS）8 mL﹒kg-1，速度为0.5 mL﹒min-1。术后6 h再次乙醚麻醉按上述推注相同剂量的NS；A组、B组和AB组按上述相同时间、相同途径两次分别使用丹参注射液4 mL﹒kg-1、氢化可的松10 mg﹒kg-1、丹参注射液4 mL﹒kg-1和氢化可的松10 mg﹒kg-1，用NS稀释药物，用量为8 mL﹒kg-1。术后所有动物禁食，自由饮水。

2.2.3 取标本 各组动物于术后18 h乙醚麻醉后再开腹，自下腔静脉采血约4 mL，3000 r﹒min-1离心15 min，各取血清约0.5 mL装入2个EP管，置于-80 ℃冰箱内保存待批量检测。快速切取胰腺组织块，最大不超过0.5 mm x 0.8 mm，去除筋膜、血管等结缔组织后，分装入2个EP管置于-80 ℃冰箱内保存，余胰腺组织块以10%甲醛溶液固定，并放入4 ℃冰箱内保存待批量检测。所有动物均麻醉后放血死亡。

2.3 观察指标

2.3.1 一般情况 如精神状态、活动、反应、进饮及腹腔大体病理变化等。

2.3.2 胰腺组织IP3 将胰腺组织用电子天平称重后放入0.01 M，PH7.2-7.4的PBS液(组织重量与PBS体积之比为1:10)，在冰浴条件下用超声波分解器行超声匀浆，匀浆液以3000 r﹒min-1离心15 min，收集上清液并参照大鼠三磷酸肌醇ELISA试剂盒使用说明书测定。2.3.3 胰腺细胞内钙（Ca2+） 参照FLUO-3、AM Ester试剂盒说明书、邓丕兰等[9]的方法，将FLUO-3、AM Ester加入90 μL DMSO，均分装为12管（暂未使用者放-80 ℃冰箱内保存），取1管加入无钙PBS液1.5 mL配制成5 mmol﹒L-1液备用。加少量无钙PBS液，用机械法剪碎胰腺组织，用孔径500 μm的尼龙滤膜过滤后，以无钙PBS 1 mL清洗，3000 r﹒min-1离心10 min，收集沉积物再洗涤、离心1次，再将第二次沉积物用适量无钙PBS液稀释调整为每毫升单个腺泡细胞数目为106的悬液（用台盼蓝染色检查成活细胞在95%以上），与荧光剂反应后用流式细胞仪测定。

再过两年多的时间，中国就将庆祝共和国五十周岁的诞辰；而人类将喜迎一个新世纪的千岁新年。我深信不疑，香港将在那个双喜临门的时刻，用更加美好的生活，向祖国献礼；带着更加辉煌的成就，跨进新世纪。

2.3.4 血清肿瘤坏死因子α（TNF-α） 参照大鼠TNF-α ELISA试剂盒使用说明书测定。

2.3.5 血清淀粉酶（AMY）、血清钙（血钙） 各组血清标本均用全自动生化分析仪测定。

2.3.6 胰腺组织病理学检查 各组取相同部位胰腺组织用10%中性甲醛液固定，石蜡包埋，连续5 μm切片后行HE染色，光镜下观察，参照 Kusske 标准[10]进行评分。

2.4 统计学处理

2.5 结果

2.5.1 一般情况 C组动物复苏后一般情况良好，活动，反应敏捷，可进饮，无精神萎靡等现象。SAP组动物精神萎靡、蜷曲、不活动、反应差，不进饮。A组、B组和AB组动物一般情况较SAP组好，但较C组稍差。

2.5.2 各组动物胰腺IP3、Ca2+和TNF-α的变化 结果见表1，SAP组的胰腺IP3、胰腺Ca2+和TNF-α显著高于A组、B组、AB组和C组（p＜0.05，AB组和C组明显低于A组和B组（p＜0.05），A组与B组间无明显差异（p＞0.05），其中C组的胰腺IP3和Ca2+明显低于AB组（p＜0.05）。

表1 各组大鼠胰腺IP3、Ca2+和TNF-α的变化()

表1 各组大鼠胰腺IP3、Ca2+和TNF-α的变化()

注：▲与SAP组比较p＜0﹒05；★与A组和B组比较p＜0﹒05；●与AB组比较p＜0﹒05。

胰腺细胞内钙 TNF-α(pg﹒mL-1)（只） (ng﹒mL-1) n 胰腺细胞内IP3组别SAP A B A B C 10 10 10 10 10 252.99±35.72 181.24±39.83▲183.78±42.84▲132.07±23.72▲★57.28±48.66▲★·10.63±2.38 7.00±0.55▲7.29±0.57▲4.40±1.81▲★2.50±1.04▲★·281.66±106.83 142.32±18.92▲138.31±20.73▲68.36±39.63▲★42.27±16.75▲★

2.5.3 各组动物血清AMY和血钙的变化 结果见表2可见，SAP组的血清AMY显著高于A组、B组、AB组和C组（p＜0.05），AB组和C组明显低于A组和B组（p＜0.05），C组明显低于A组、B组和AB组（p＜0.05），但A组与B组间无明显差异（p＞0.05）。SAP组的血钙显著低于A组、B组、AB组和C组（p＜0.05），C组和AB组明显高于A组、B组（p＜0.05），但A组与B组间无明显差异（p＞0.05）。

表2 各组动物血清AMY和血钙的变化()

表2 各组动物血清AMY和血钙的变化()

注：▲与SAP组比较p＜0.05；★与A组和B组比较p＜0.05；·与AB组比较p＜0.05。

 组别 n（只） AMY(u) 血钙（mmol﹒L-1）SAP A B AB C 10 10 10 10 10 5336.1±1937.83 2431.7±453.82▲2486.6±420.96▲1423.9±290.12▲★783.5±200.07▲★·2.51±0.11 2.69±0.07▲2.66±0.08▲2.83±0.08▲★3.04±0.15▲★·

2.5.4 各组动物胰腺细胞IP3与Ca2+、TNF-α及血钙的关系 胰腺细胞IP3与Ca2+和TNF-α间呈明显正相关，相关系数（r）分别为0.987、0.937和0.976（p＜0.05)。上述三者与血钙呈显著负相关， r分别为-0.997、-0.980和-0.915（p＜0.05)。结果见图1。

图1 5组动物胰腺内IP3、胞内钙、TNF-α和血钙间对数值变化

2.5.5 腹腔和胰腺组织病理改变 C组大鼠的腹腔、胃肠和胰腺及胰周围无明显改变。SAP组大鼠的腹腔内有大量血性腹水，胃肠显著扩张，胰腺大片出血、坏死，大量中性粒细胞浸润和小叶出血，胰腺表面、大网膜、肠系膜等可见大量皂化斑。A组、B组和AB组大鼠可见少量淡血性腹水，胃肠轻度扩张，胰腺以充血、水肿为多见，有少量中性粒细胞浸润，偶见点状出血、坏死和皂化斑等。胰腺病理评分，SAP组评分（11.1±0.88）显著高于A组(9.2±0.45)、B组(8.6±1.82)、AB组(7.5±1.08)和C组(6.4±1.07，p＜0.05)，C组明显低于A组、B组和AB组（p＜0.05)，AB组明显低于A组（p＜0.05)，但与B组间无明显差异（p＞0.05），A组与B组间无明显差异（p＞0.05）。

3 讨论

3.1 SAP胰腺细胞IP3和Ca2+、血钙及TNF-α的变化及其相互关系

在乙酰胆碱等刺激下，细胞膜IP3生成后，从膜上扩散至胞浆中并与内质网上的受体（即实际上的Ca2+通道）结合，使IP3操纵的钙通道活化、大量开放，大量Ca2+从钙库内迅速释放，造成胞浆内Ca2+浓度急剧升高[11]。胞浆内Ca2+又可作为细胞内第二信使，激活钙库膜上的受体，使钙库排钙，出现“钙诱发的钙释放”（calcium induced calcium release, CICR)现象[12～13]。随着钙库钙的释放，继而细胞膜上操纵Ca2+通道的开放，引起充电式Ca2+内流，促进细胞外Ca2+向细胞内转移[12,14～16]。因此IP3是细胞内钙信号相关的第二信使，其与相应受体结合可以调控细胞内钙释放。观察显示，AP时存在细胞内钙超载[4]。本研究发现，SAP时胰腺细胞IP3明显高于对照组，相应地细胞内钙亦显著高于对照组，呈明显正相关(r=0.987)，而血钙却明显降低，表现为负相关(r=-0.997)，提示SAP时存在细胞IP3的异常，从而导致钙代谢异常，即细胞内钙释放致细胞内钙水平上升，细胞外钙向细胞内转移致细胞外钙水平下降；SAP时出现的钙超载其重要原因之一是细胞内IP3出现异常所致。

较多研究指出，AP发生后，炎症细胞产生过量的TNF-α，一方面其可引起胰腺细胞坏死，另一方面其迅速进入血液循环，促进其他细胞因子的产生，引起细胞因子级联反应，导致全身炎症反应综合征（Systemic infammatory response syndrome,SIRS ）和多器官功能障碍综合征（Multiple organ dysfunction syndrome,MODS）[17～18]。AP时存在细胞内钙超载[4],临床使用钙拮抗剂异搏定治疗AP，可使血清TNF-α明显降低[19]，提示钙超载与TNF-α有关。本研究结果显示，SAP组血清TNF–α水平显著高于对照组，并与细胞IP3和Ca2+水平呈正相关（r分别为0.937和0.976），SAP组的胰腺病理评分明显高于对照组，说明SAP时TNF–α的增高与细胞IP3升高诱发的细胞内钙超载相关。

3.2 丹参和糖皮质激素对SAP胰腺细胞IP3、Ca2+、血钙及TNF-α的影响

临床上使用丹参可抑制SAP时TNF-α分泌[15]。本实验结果发现丹参治疗SAP后，细胞IP3水平明显降低，Ca2+浓度显著下降，与此同时血钙显著回升，TNF-α明显下降，血AMY水平及胰腺组织病理评分均有明显改善，提示丹参对AP的治疗作用可能是通过降低细胞IP3水平，依次进而降低Ca2+及其TNF-α水平而实现的。

糖皮质激素具有抑制炎症介质、清除自由基和改善微循环等作用。有实验应用甲基强的松龙可使SAP时TNF-α的高水平和血钙下降水平均得以改善[17～18]。本研究中应用氢化可的松后，细胞IP3、Ca2+和TNF-α明显下降, 相应地AMY和胰腺病理评分均显著降低，而血钙显著回升，表明糖皮质激素对AP有一定治疗作用，其机制之一可能是首先降低细胞IP3，减少钙超载，从而抑制TNF-α释放。

在本研究中，当联合使用丹参和糖皮质激素治疗SAP后，细胞IP3、Ca2+、TNF-α、AMY、胰腺病理评分均比SAP组显著下降，比单独使用丹参或糖皮质激素有不同程度降低，其中Ca2+显著下降，血钙明显恢复，胰腺病理评分和AMY显著降低，提示联合使用丹参和糖皮质激素有协同作用，比单用效果好。研究还发现，不管单独使用丹参或糖皮质激素，还是二者联合使用，细胞内IP3虽然明显下降，但仍然明显高于对照组，其原因可能与实验观察时间过短等有关，有待进一步研究。

[1] Winslet M, Hall C, London NJ, Neoptolemos JP. Relationship of diagnostic scrum amylase levels to aetiology and severity of acute panereatitis[J]. Gut, 1992,33:982.

[2] 刘学民,黄建勇,潘承恩,等.重症急性胰腺炎23例死亡原因分析[J].陕西医学杂志,2002,31:411.

[3] 孙备,董承刚,王刚,等.重症急性胰腺炎死亡的高危因素分析[J].中华外科杂志,2007,45 (23):1619.

[4] Kim JY, Kim KH, Lee JA, et al. Transporter-mediated bile acid uptake causes Ca2+-dependent cell death in rat pancreatic acinar cells[J]. Gastroenterology.,2002,122(7):1941.

[5] Petersen OH, Sutton R. Ca2+signalling and pancreatitis: effects of alcohol, bile and coffee[J]. Trends Pharmacol Sci.,2006,27: 113.

[6] 刘景生.细胞信息与调控.第1版.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1999:83.

[7] Aho HJ, Koskensalo SM, Nevalainen TJ. Experimental pancreatitis in the rat. Ultrastructure of sodium taurocholateinduced pancreatic lesions[J]. Scand J Gastroenterol,1980,15: 417.

[8] 张水军,翟文龙,赵永福,等.雷公藤内脂醇对大鼠重症急性胰腺的治疗作用[J].世界华人消化杂志,2005,13:997.

[9] 邓丕兰,赵琳媚.冠心病患者血细胞内钙含量对血黏度的影响[J] .中国老年学杂志,2006;26:738.

[10] Kusske AM, Rongione AJ, Ashley SW, et al. Interleukin- 10 prevents death in lethal necrotizing pancreatitis in mice[J]. Surgery 1996,120:284-288;discrssion 289.

[11] 查锡良.医学分子生物学,第1版.北京:人民卫生出版社,2003:417.

[12] Putney JW Jr, Broad LM, Braun FJ,et al. Mechanisms of capacitative calcium entry[J]. J Cell Sci, 2001,114: 2223.

[13] 车艳,Simon Potocnik,李春光,等.钙贮库调控的钙通道的药理与分子生物学特征[J].中国药理学通报,2002, 18: 365.

[14] Tribe RM, Moriarty P, Dalrymple A, et al. Interleukin-1beta induces calcium transients and enhances basal and store operated calcium entry in human myometrial smooth muscle[J]. Biol Reprod, 2003,68: 1842.

[15] Terry CM, Clikeman JA, Hoidal JR, et al. TNF-alpha and IL-1alpha induce heme oxygenase-1 via protein kinase C, Ca2+, and phospholipase A2 in endothelial cells[J]. Am J Physiol, 1999,276: H1493.

[16] Spörri B, Müller KM, Wiesmann U, et al. Soluble IL-6 receptor induces calcium flux and selectively modulates chemokine expression in human dermal fibroblasts[J]. Int Immunol, 1999,11: 1053.

[17] Kingsnorth A. Role of cytokines and their inhibitors in acute pancreatitis[J]. Gut 1997, 40: 1.

[18] Sakor a f a s GH, Ts iotou AG. Et iology and pathogenesis of acute pancreatitis: current concepts[J]. J Clin Gastroenterol 2000, 30: 343.

[19] 蒲青凡, 严律南, 孙碎康, 等. 改善胰腺缺血和钙拮抗剂在急性重症胰腺炎治疗中的保护作用[J]. 中国普外基础与临床杂志,2001, 8: 384.

(责任编辑：何瑶)

Infuence of Danshen and glucocorticoid on inositol triphosphate and calcium metabolism in rats with severe acute pancreatitis

WANG Hang, SHI Cheng-xian//( 1. Sixth People's Hospital of Chongqing, Chongqing 400060; 2. Guizhou Provincial People’s Hospital Guiyang 550002, Guizhou)

Objective:To investigate the changes of inositol triphosphate (IP3) and the relation between the IP3 and calcium metabolism，and the effect of Danshen and glucocorticoid on the change in rats with severe acute pancreatitis(SAP).Method:Fifty Sprague-Dawley rats were randomly divided into fve groups: severe acute Pancreatitis group (group SAP), treatment group of Danshen (group A), treatment group of dermacort (group B), Danshen and dermacort treatment group (group AB), and control group (group C). The model of SAP was induced by 3% Sodium Taurocholate. After operation, normal sodium (NS) was injected by vena in group SAP and C. However the group C was ham operation. The model of group A, B and AB were established as group SAP. But Danshen were administered in group A and dermacort in group B, the integrated Danshen and dermacort were used in group AB. Serum amylase(AMY), calcium and tumor necrosis factor α(TNF-α) were examined. Intracellular IP3 and Ca2+, and histological change and pathological scores of pancreas （PSP）were observed after 18 h.Result:The IP3，Ca2+，TNF-α，AMY and PSP in group SAP were signifcantly higher than those in group A，group B，group AB and group C（p＜0.05). And those in group AB were significantly lower than those in group A and group B（p＜0.05)，but there were not signifcantly different between group A and group B( p＞0.05).The PSP in group C were signifcantly lower than those in group A，group B and group AB（p＜0.05), but the IP3 and Ca2+in group C were signifcantly lower than those in group AB. There were not signifcantly different of TNF-α between group AB and group C. The IP3 of pancreas was positive correlation with Ca2+and TNF-α and negative relation with the serum calcium in SAP（r = 0.987, r = 0.937, p＜0.05). Serum calcium in group SAP were significantly lower than those in group A，group B，group AB and group C（p＜0.05), however that in group AB and group C were signifcantly higher than those in group A group B. Serum calcium in group AB was signifcantly lower than those in group C, but there were not signifcantly different between group A and group B. IP3, Ca2+and TNF-α were negative related with the serum calcium in SAP (r=-0.997、-0.980和-0.915，p＜0.05).Conclusion:There are signifcantly increase of the pancreatic cell IP3, and the increase of IP3 is positive related with the Ca2+and TNF-α. And IP3, Ca2+and TNF-α are negative related withthe serum calcium in SAP. It show that the IP3 is a main factor inducing abnormity of calcium metabolism in SAP. Danshen and glucocorticoid may respectively restrain the release of IP3, however the effects of both medicine integration is better than single medicine.

Severe acute pancreatitis; inositol triphosphate (IP3); intracellular calcium (Ca2+); Danshen; glucocorticoid;

R 283

A

1674-926X(2014)03-007-04

贵州省优秀人才基金资助项目(20060-36)

1. 重庆市第六人民医院，重庆 400060 2. 贵州省人民医院，贵州 贵阳 550002

王行，男Email:wanghang751115@163.com

石承先，男，教授，博士生导师

2013-11-01