RP-HPLC法测定人血浆中莫西沙星的浓度

黄 娟，雍小兰，冯仕银，王蓝天，杜晓琳，李 楠（成都军区总医院临床药学科，成都 610083）

盐酸莫西沙星为第四代新型喹诺酮类超广谱抗菌药物，其抗菌谱覆盖了全部呼吸道主要致病菌，主要用于慢性支气管炎急性加剧者、社区获得性肺炎以及急性细菌性鼻窦炎。莫西沙星具有良好的药动学特性，口服吸收良好，生物利用度高，具有良好的组织穿透力[1]，目前已广泛应用于临床。测定动物和人血浆中的莫西沙星浓度的方法已有报道[2-8]，但本试验选择氟康唑为内标，性质稳定、提取回收率高；流动相简单，不含磷酸缓冲盐；经液-液萃取样品干净，回收率稳定，具有一定的优越性。该反相高效液相色谱（RP-HPLC）法具有操作简便、准确、灵敏度高、专属性强、重复性好、试剂便宜等优点，适用于莫西沙星的临床血药浓度测定和药动学研究以及Ⅰ期临床试验。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AB135-S十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Thermo ST16R型冷冻离心机（美国热电公司，离心半径：16 cm）；涡旋混合器（北京踏锦科技有限公司）；－80 ℃低温冰箱（中国海尔公司）；Turbo Vap LV型浓缩仪（美国Caliper公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂

盐酸莫西沙星对照品（德国拜耳公司，纯度：96.2%，批号：R-1004-01G）；内标：氟康唑对照品（中国食品药品检定研究院，纯度：99.9%，批号：100314-200503）；甲醇、乙腈均为色谱纯，二氯甲烷、乙醚为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（含0.05%三氟醋酸，22∶78）；流速：1.0 ml/min；检测波长：296 nm（0～2.5 min）、256 nm（2.5～4.5 min）、296 nm（4.5～8.0 min）；柱温：25 ℃；进样量：20 μl。在该试验条件下，莫西沙星与内标能完全分离，不受血浆内源性杂质干扰，莫西沙星与内标的保留时间分别为6.2 min与3.4 min。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+2.0 μg/ml莫西沙星溶液+内标（200 μg/ml氟康唑对照品）溶液；C.给药后2 h的血浆样品；1.氟康唑；2.莫西沙星Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+2.0 μg/ml moxifloxacin+200 μg/ml internal standard；C.plasma sample 2 h after medication；1.fluconazole；2.moxifloxacin

2.2 溶液的配制

（1）对照品贮备液：准确称取盐酸莫西沙星对照品5.46 mg（相当于莫西沙星5.0 mg）于5 ml量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，得莫西沙星贮备液。（2）内标溶液：准确称取氟康唑对照品40.31 mg于10 ml量瓶中，用甲醇-水（1∶1）定容，得内标贮备液；取内标贮备液，用甲醇-水（1∶1）稀释，配制成200 μg/ml的内标溶液，于4 ℃下保存，备用。（3）萃取剂：乙醚-二氯甲烷（3∶2）。

2.3 血浆样品的处理

精密吸取血浆200 μl，加入10 μg/ml内标氟康唑溶液100 μl，混匀后加入萃取剂4 ml，涡旋混匀5 min。于3 200 r/min离心10 min，转移上层有机相于尖底试管中，30 ℃水浴氮气流吹干。残渣用甲醇-水（1∶1）100 μl复溶，进样20 μl。

2.4 线性关系及定量下限考察

取空白血浆配制成含莫西沙星分别为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μg/ml的系列标准血浆样品，其余按“2.3”项下方法处理，记录色谱。以莫西沙星峰面积与内标峰面积的比值（y）与对应浓度（x）进行线性回归，得回归方程：y＝94.02x－0.005（r＝0.999 6）。结果表明，莫西沙星血药浓度在0.05～10 μg/ml范围内线性关系良好，定量下限为0.05 μg/ml。定量下限的精密度RSD和回收率分别为1.87%和108.79%（n＝5）。

2.5 精密度试验

配制莫西沙星为0.2、2.0、8.0 μg/ml的低、中、高3个质量浓度的质控血浆样本，各6份，按“2.3”项下方法处理，根据当日标准曲线计算日内精密度；连续测定3 d，计算日间精密度，结果见表1。结果表明，本试验所建立的方法的精密度与准确度均达到试验要求。

表1 精密度及回收率试验结果（n＝6）Tab 1 Results of precision and recovery tests（n＝6）

2.6 回收率试验

配制莫西沙星为0.2、2.0、8.0 μg/ml的低、中、高3个质量浓度的质控血浆样本，各3份，按“2.3”项下方法处理，测定所得莫西沙星峰面积与对应质量浓度对照品溶液直接进样所得峰面积相比，计算提取回收率；根据当日标准曲线求得实测质量浓度，以实测值与理论值相比计算方法回收率，结果见表1。其中，内标的提取回收率为97.31%。

2.7 稳定性试验

配制莫西沙星为0.2、2.0、8.0 μg/ml的低、中、高3个质量浓度的质控血浆样本，按“2.3”项下方法处理。分别考察了血浆样本室温放置8 h、反复冻融3次以及－80 ℃冷冻放置30 d的稳定性，结果见表2。结果表明，在上述稳定性考察条件下，莫西沙星的质量浓度均保持稳定，未出现明显变化。

表2 稳定性试验结果（，n＝3）Tab 2 Results of stability tests（，n＝3）

表2 稳定性试验结果（，n＝3）Tab 2 Results of stability tests（，n＝3）

2.8 样品测定

结核性胸膜炎患者静脉滴注盐酸莫西沙星注射液400 mg，给药后0.3、2、4 h时采集前臂静脉血3 ml，分离血浆，按“2.3”项下方法处理后进样测定，结果分别为3.16、2.27、1.97 μg/ml。

3 讨论

目前血浆中莫西沙星浓度的测定方法主要有高效液相色谱荧光检测法[3]、高效液相色谱紫外检测法[4-7]和液-质联用法[8]。与紫外检测相比，荧光检测法的应用范围较窄，对干扰非常敏感；液质联用法则成本高。故本试验采用了RP-HPLC法，选择氟康唑为内标。因为氟康唑的吸收波长为256 nm，莫西沙星的吸收波长为296 nm，所以采用了分段改变波长的方法进行检测，二者的分离度符合要求，切换波长不影响检测。与文献[2-6]相比，本试验的流动相简单，不含磷酸缓冲盐，莫西沙星出峰时间短，具有一定的优越性。

本试验选用乙醚-二氯甲烷作萃取剂，不用调酸碱度。与文献[4-5]中使用的样本量相比，本试验所用血浆量更少，从0.5、1 ml减少到0.2 ml。文献[5]中，健康志愿者单剂量口服400 mg莫西沙星后，血浆峰值浓度为（3.06±0.42）μg/ml，本试验的定量下限为0.05 μg/ml，能满足峰值浓度的1/20的要求，可应用于其药动学和生物等效性研究。

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