HPLC 法同时测定双黄连颗粒中绿原酸、木犀草苷、连翘苷和黄芩苷的含量

宁科贤，黄燕萍（1.广西医科大学第一附属医院药学部，南宁 530021；2.广西北海食品药品检验所，广西北海 536000）

双黄连颗粒是由金银花、黄芩、连翘3味中药经适宜加工、提取制成的中成药，收载于《中国药典》2010年版（一部）[1]，具有疏风解表、清热解毒之功效，临床用于治疗外感风热所致的感冒，症见发热、咳嗽、咽痛。原标准仅有黄芩苷和连翘苷的含量测定项。有文献报道单独或同时测定双黄连颗粒中绿原酸、连翘苷、黄芩苷的含量[2-5]，但尚未见同时测定该制剂中绿原酸、木犀草苷、连翘苷和黄芩苷4 种成分含量的报道。本试验参考有关文献[1-12]，建立了以高效液相色谱（HPLC）法同时测定双黄连颗粒中绿原酸、木犀草苷、连翘苷和黄芩苷含量的方法，现报道如下。

1 材料

1200 型HPLC 仪，包含Agilent 1200 LC 色谱工作站、G1322A（DEGASSER）溶剂脱气机、G1311A（Quat Pump）四元泵、G1329A（ALS）自动进样器、G1314B VWD 紫外检测器（美国Agilent 公司）；CP225D 型电子天平（德国赛多利斯公司）；AW-120 型电子天平（西班牙COBOS 公司）；SB3200S 型超声波清洗器[必能信超声（上海）有限公司]；HT-203A column HEATER型柱温箱（天津市恒奥科技发展有限公司）。

绿原酸、木犀草苷、连翘苷和黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110753-201314、111720-201106、110821-201112、110715-200815，质量分数：96.6%、99.3%、91.8%、95.2%）；双黄连颗粒（哈尔滨儿童制药厂有限公司，批号： 130332；哈药集团中药二厂，批号：130629、130526）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.4%磷酸溶液（B），采用梯度洗脱（梯度洗脱程序见表1）；检测波长：277 nm；流速：0.80 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：10µl。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab 1 Mobile phase gradient elution program

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取绿原酸、木犀草苷、连翘苷和黄芩苷对照品适量，以甲醇为溶剂，配制成每1 ml含绿原酸0.391 mg、木犀草苷0.084 mg、连翘苷0.183 mg、黄芩苷0.415 mg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品内容物适量，研细，取约0.2 g，精密称定，精密加入70%甲醇20 ml，称定质量，超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，中速滤纸滤过，滤液再用0.45 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方中药味的比例，分别制备不含黄芩、不含连翘和不含金银花的模拟样品，按其工艺制成阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 系统适用性试验

分别取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量，注入HPLC仪，进样，记录色谱，详见图1。由图1可见，绿原酸峰、木犀草苷峰、连翘苷峰和黄芩苷峰与相邻组分峰的分离度均大于1.5，理论板数按绿原酸峰计大于9 000；且阴性样品在对照品色谱峰相应的位置上无吸收峰出现，表明处方中的其他成分对测定结果无影响。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C 缺黄芩阴性对照；D：缺连翘阴性对照；E.缺金银花阴性对照；1.绿原酸；2.木犀草苷；3.连翘苷；4.黄芩苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control without Scutellaria baicalensis；D.negative control without Forsythia suspensa；E.negative control without Lonicera japonica；1.chlorogenic acid；2.luteolin；3.forsythin；4.baicalin

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ml，分别置于10 ml 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱。以检测质量浓度为横坐标（x，µg/ml），峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，回归方程及线性范围详见表2。

表2 回归方程及线性范围Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10µl，按“2.1”项下色谱条件重复进样6 次，测定峰面积。结果，绿原酸、木犀草苷、连翘苷和黄芩苷峰面积的RSD 分别为0.61%、0.95%、0.73%和0.32%，表明仪器的精度良好。

2.6 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：130332）适量，分别在放置0、1、2、4、6、8、10、12 h 时按“2.1”项下色谱条件进样10µl，测定峰面积。结果，绿原酸、木犀草苷、连翘苷和黄芩苷峰面积的RSD 分别为0.91%、1.07%、0.88%和0.91%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取样品（批号：130332）细粉约0.2g，共6 份，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，各按“2.1”项下色谱条件进样10µl，测定并计算含量。结果，绿原酸、木犀草苷、连翘苷和黄芩苷的平均含量分别为1.476 5、0.235 3、2.413 6、24.384 2 mg/g，RSD 分别为1.02%、1.23%、0.87%、0.79%，表明本方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知各成分含量的样品（批号：130332）细粉9份，每份约0.1 g，精密称定，每3份分别精密加入一定量的绿原酸、木犀草苷、连翘苷和黄芩苷对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表3。

2.9 样品含量测定

取不同批号的双黄连颗粒，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积，以外标一点法计算绿原酸、木犀草苷、连翘苷和黄芩苷的含量，结果见表4。

表3 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 3 Result of recovery tests（n＝9）

表4 样品含量测定结果（mg/g，n＝3）Tab 4 Results of content determination of samples（mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 流动相的选择

本试验参照《中国药典》2010年版（一部）比较了甲醇-水-冰醋酸（50 ∶5 ∶1，V/V/V）、乙腈-水（25 ∶75，V/V）、甲醇-水-磷酸（47 ∶53 ∶0.2，V/V/V）、乙腈-0.4%磷酸溶液（13 ∶87，V/V）、甲醇-0.4%磷酸溶液等不同流动相的出峰情况。结果发现，对双黄连颗粒而言选择甲醇-0.4%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，待测成分分离较好且峰形较佳。

3.2 检测波长的选择

经紫外-可见分光光度法测定，绿原酸在277 和324 nm 波长处有最大吸收，连翘苷的最大吸收波长为277 nm，黄芩苷在276 和315 nm 波长处有最大吸收，木犀草苷在255 和350 nm波长处有最大吸收。进而比较了混合对照品溶液各成分在255和277 nm波长下的峰面积，发现绿原酸变化不大，木犀草苷在277 nm 下的峰面积是255 nm 下的61%，而连翘苷在255 nm下的信号很弱，黄芩苷的信号则增强了2.5倍。故最终选用277 nm为本试验的测定波长，以提高各种成分的检测灵敏度。

3.3 提取溶剂及方法的选择

分别用甲醇、70%甲醇和70%乙醇加热回流或超声处理等进行样品提取考察。结果发现，采用70%甲醇超声处理（功率：250 W，频率：40 kHz）30 min 提取效果最佳。故本试验最终选用此提取溶剂及方法。

3.4 其他

表4 的结果表明，不同生产厂家的绿原酸、连翘苷含量差异较大；而同一厂家不同批号的产品则是木犀草苷和黄芩苷含量差异较大，这可能是由于药材的品质及工艺的差别所造成。但是，各厂家药物的用法与用量却相同，这使得本品在临床应用时，有可能会产生较大的药效偏差，甚至产生副作用。因此，为了保证患者的用药安全，需更好地完善其质量标准以有效反映制剂质量。

综上所述，本方法简便、准确、重复性好，可用于双黄连颗粒的质量控制。

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