香鱼(Plecoglossus altivelis)养殖群体遗传多样性的AFLP分析及性别特异性分子标记筛选*

闫松松 苗 亮 李明云 范慧慧 胡 谋 陈 炯 史雨红

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室 宁波 315211)

香鱼(Plecoglossus altivelis)属胡瓜鱼目(Osmeriformes)、香鱼科(Plecoglossidae)、香鱼属(Plecoglossus),是一种小型名贵经济鱼类,有“淡水鱼之王”的美称。目前中国大陆的野生香鱼资源已濒临枯竭,自 20世纪80年代末、90年代初实现全人工育苗和养殖以来,香鱼养殖业获得了很大的发展(李明云等,1999)。国内研究人员已对香鱼的繁殖生物学、育苗与养殖技术以及病害与免疫等方面进行了较多研究(李明云等,2000,2012;Shimizuet al,2008;Liet al,2011;范慧慧等,2012),但在群体遗传多样性方面仅有少数对野生群体的研究报道:同工酶分析显示宁波凫溪野生香鱼的遗传多样性较丰富(黄福勇等,2004);线粒体Cytb基因和D-loop区的多态性分析则显示浙江瑞安、福建宁德和福建东张水库 3个香鱼野生群体的遗传多样性水平都不高,特别是东张水库群体的遗传多样性非常贫乏(李娜等,2008;鲁延付等,2009)。而香鱼养殖群体受有效繁殖群体较小、近亲交配等影响,也面临种质退化的危险。因此有必要了解养殖香鱼群体的遗传多样性,以便采取措施保护香鱼资源。另外,香鱼雌鱼比雄鱼的经济价值更高,如果能够实现全雌养殖,可大幅提高经济效益。虽然已对香鱼进行了雌核发育诱导研究(Taniguchiet al,1988,1990),但目前尚没有可以鉴定香鱼遗传性别的方法。

AFLP(Amplified fragment length polymorphism)即扩增片段长度多态性,是由Zabeau和Vos(1993)发明的一种检测 DNA多态性的方法,具有无需知道DNA序列信息、扩增条带多、灵敏度高、重复性好、多态性丰富等优点,已被广泛用于遗传结构分析、遗传图谱构建、性别特异性标记筛选、种质资源鉴定等诸多领域(Nakamuraet al,2001;王伟继等,2005;张滔等,2013)。特别是使用 AFLP技术已经在三刺鱼(Griffithset al,2000)、半滑舌鳎(Chenet al,2007)、罗非鱼(杨东等,2007)、鲤鱼(Chenet al,2010)等多种鱼类中筛选到了性别特异性分子标记。

本文用 AFLP技术分析香鱼养殖群体的遗传多样性,同时筛选与性别相关的分子标记,以期为香鱼养殖群体的遗传改良和性别调控研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用鱼均为采自浙江省宁海县凫溪香鱼养殖场的性成熟香鱼(体重70—120g),共2批,其中2010年9月随机采集雌性香鱼15尾,雄性香鱼15尾,共30尾用于AFLP分析,2011年9月随机采集雌性香鱼5尾,雄性香鱼5尾,共10尾用于性别特异性标记验证。所取香鱼均解剖鉴定生理性别后取背部肌肉,液氮速冻后–80°C保存,使用常规酚氯仿法提取香鱼肌肉基因组DNA。

1.2 AFLP分析

AFLP实验方法按照试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)说明书进行。基因组DNA经EcoR I/MseI双酶切后与接头相连接,先进行预扩增,用15对引物组合进行选择性扩增(引物组合见表1,其中E代表GACTGCGTACCAATTC,M代表GATGAGTC CTGAGTAA)。选扩产物进行8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色显示条带,凝胶成像后用 Quantity One 4.62(Bio-Rad公司)统计、分析条带。用POPGEN 1.31计算多态性比例P、基因多样性指数H、Shannon氏指数I等遗传多样性参数(刘翠等,2011)。根据个体之间的遗传相似系数,采用 NTSYS软件以UPGMA法对30个个体做聚类分析,绘制亲缘关系树。

1.3 性别特异性条带筛选

对经解剖确定性别的香鱼,进行雌、雄两性间的AFLP扩增条带对比,性别特异性条带用聚丙烯酰胺胶回收试剂盒(OMEGA公司)回收后克隆至pMD19-T载体(Takara公司)中进行测序。用DNAMAN 4.0进行序列比对,并在GenBank中进行BLAST检测。

1.4 性别特异性引物设计与PCR验证

根据测序结果,设计 1对 PCR 引物(上游 5′CAATTCATGTCCCATCATCAC 3’;下游 5’ GAGTAA CTGCATTTTTCTGCC 3’),以香鱼基因组DNA为模板进行 PCR扩增,程序为:94°C预变性 1min;94°C变性30s,56°C退火30s,72°C延伸1min,循环30次;72°C延伸5min;6°C保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 养殖群体的遗传多样性

用 15对选扩引物组合对 30尾养殖香鱼进行AFLP扩增,条带分析结果见表1。各对引物组合的扩增条带数为 41—72个,其中多态性条带数为 15—46个,各位点的多态率为 22.39%—70.77%;共扩增到889个位点(平均每对引物59.27个),其中多态性位点共 380个(平均每对引物 25.33个),占总位点数的42.74%;被测群体的Nei氏遗传多样性指数为0.0727—0.2724(平均 0.1454),Shannon氏指数为 0.1111—0.3971(平均 0.2174)。群体内个体间的遗传相似度最高为 0.9393,最低为 0.7975,平均遗传相似度为0.8575;遗传距离在 0.0607—0.2025之间(平均0.1425)。

表1 香鱼养殖群体的AFLP遗传多样性Tab.1 AFLP genetic diversity of cultured P.altivelis

2.2 性别特异性标记的筛选与验证

由图1可见,在15对选扩引物组合中,仅引物组合 E-ATG/M-CTG扩增到一条雄性特异性条带。切胶回收后测序显示该片段含有 139个碱基,序列见图2,15尾雄性个体中该片段的碱基序列一致。经BLAST检索,在GenBank中未找到任何与该片段同源的序列。

图1 香鱼雄性特异性AFLP条带(引物组合:E-ATG/M-CTG)Fig.1 The male-special AFLP band of P.altivelis(primer pairs:E-ATG/M-CTG)

图2 香鱼雄性特异性AFLP条带的碱基序列(小写字母示引物序列)Fig.2 DNA sequence of male-special AFLP marker in P.altivelis(lowercase letters show the primers)

根据雄性特异性条带的测序结果设计 1对 PCR引物,对经解剖检查性腺确定性别10尾香鱼(雌、雄各5尾)的基因组DNA进行扩增,电泳结果显示5尾雄性个体中均能扩增到一条特异的、大小为120bp的DNA条带,而5尾雌性个体中均无此目标条带(图3)。表明该 DNA标记是雄性特异性的,并可通过普通PCR扩增检测香鱼个体的遗传性别鉴定。

图3 香鱼雄性特异性标记的PCR验证Fig.3 PCR identification of the male-special marker in P.altivelis

3 讨论

3.1 遗传多样性水平

生物群体的遗传多样性是评价生物资源状况的一个重要依据,它是物种适应多变的环境、维持长期生存和进化的遗传基础。自20世纪80、90年代以来,我国香鱼自然资源锐减,多处地方的野生香鱼濒临灭绝,有的甚至已经绝迹(李明云等,1999)。香鱼已被列入中国濒危动物红皮书,浙江、福建、河北、辽宁等地将其列为省级重点保护动物,并进行了人工养殖、增殖放流和野生资源调查与保护等方面的工作。研究香鱼的群体遗传结构和多样性对于保护香鱼资源、避免种质退化、指导增殖放流等都有重要意义。

黄福勇等(2004)对宁波凫溪野生香鱼的同工酶生化遗传分析结果显示该群体的遗传多样性较丰富。而对浙江瑞安、福建宁德和福建东张水库3个香鱼野生地理群体的线粒体 Cytb基因、D-loop序列和ND4-tRNASer基因的遗传分析显示这 3个群体的遗传多样性水平均较低,特别是东张水库群体的遗传多样性非常贫乏(李娜等,2008;鲁延付等,2009)。香鱼不同群体间的遗传多样性相差较大,这可能与各个群体间的基因交流较少有关。香鱼为一年生洄游型鱼类,成鱼秋季在河口处产卵后死亡,仔鱼移至海中越冬后于次年春季返回淡水生活,仔稚鱼受游动能力限制,活动范围和迁移距离有限,限制了不同地理群体间的基因交流,特别是有些群体还因洄游通道被阻断而成为终生在封闭淡水水体中生活的陆封型香鱼群体(如福建东张水库)。另外,有些濒危群体受有限繁殖群体数量的限制,其遗传多样性水平往往较低,如Seki等(1999)的AFLP分析结果显示日本奄美大岛川内河中濒临灭绝香鱼群体的多态位点比例仅有13.5%,而其它2个野生香鱼群体的多态位点比例则分别为55.0%和52.1%。

本研究中所用浙江宁海香鱼养殖群体已经过近10年的连续人工繁育,其 AFLP多态性位点比例(42.74%)虽低于Seki等(1999)研究的日本野生香鱼群体,但与大黄鱼(黎中宝等,2009)、半滑舌鳎(韩志强等,2007)、西伯利亚鲟(刘翠等,2011)、牙鲆(张全启等,2004)、鲤鱼(钟立强等,2010)、卵形鲳鲹(彭敏等,2011)等养殖鱼类相比,其遗传多样性仍较丰富,处于中等偏上水平。这一方面是因为其原始亲本群体——野生凫溪香鱼遗传多样性水平较高,另一方面也可能与每年的香鱼人工育苗中均使用较大数量亲本有关。但现在凫溪香鱼野生群体已基本绝迹,因此在人工育苗和养殖中一方面要避免外来群体的混杂,另一方面要采用合理的育种方法避免种质退化和遗传多样性下降。

3.2 香鱼性别特异性标记

鱼类遗传性别的鉴定在水产养殖和遗传育种领域有着重要的理论研究和应用价值,但鱼类的性别决定机制特别复杂,绝大多数鱼类并未进化出性染色体或性染色体没有异型分化,并且常染色体基因和温度、pH、光周期等环境因素也会影响鱼类的性别(Sandraet al,2010)。寻找性别特异性的分子标记是目前鉴定鱼类遗传性别的常用和有效方法之一。RAPD、SSR、AFLP、SSH的技术方法都已被用于筛选鱼类性别特异性标记(Kovacset al,2001;Chenet al,2010;Fujiet al,2010)。AFLP具有基因组覆盖率高、扩增位点丰富、条带多态性高及可重复性好等优点,已在三刺鱼(Griffithset al,2000)、海鲈(Nakamuraet al,2001)、北极鲑鱼(Rachaelet al,2003)、半滑舌鳎(Chenet al,2007)、鲤鱼(Chenet al,2010)、黄颡鱼(鲁翠云等,2007)、罗非鱼(杨东等,2007)等多种鱼类中找到了性别特异性标记或筛选到了性别差异条带。

香鱼属于胡瓜鱼目、香鱼科,目前尚未有胡瓜鱼目鱼类性别决定类型和机制等方面的研究报道。染色体核型分析显示香鱼没有异型分化的性染色体(张春丹等,2005)。Watanabe等(2004)在对日本香鱼的AFLP检测中发现选扩引物组合 E-AT/M-CTG可扩增到 1条在雄鱼中出现率为100%、雌鱼中出现率仅5%的条带,该条带长度约 141bp,但并不知道该片段的碱基序列,也未见有后续的研究报道。笔者在浙江养殖香鱼中也得到1个雄性特异性AFLP条带,扩增该条带的选扩引物组合(E-ATG/M-CTG)与 Watanabe等(2004)的相比仅相差1个碱基,条带大小也基本相同,因此笔者和 Watanabe等(2004)筛选到的香鱼雄性特异性AFLP条带应是同一片段。测序显示该雄性特异性条带含139个碱基,但GenBank中未检索到与该片段同源的序列。根据测得序列设计1对引物对10尾香鱼的基因组DNA进行PCR扩增,5尾雄鱼中均扩增到了目的片段,而5尾雌鱼中均扩增不到目的片段,这也使通过普通 PCR扩增实现香鱼遗传性别的鉴定成为了可能,并可用于雌核发育、诱导性逆转以及单性全体繁育等研究。但该片段是否与香鱼性别决定基因相连锁、该片段所在染色体是否为香鱼的性染色体等问题尚有待更进一步研究。

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