铁离子对视网膜细胞毒性的研究进展

谢海南 陈穗桦

众所周知，铁离子在细胞的发育、代谢以及功能活动中具有重要作用，铁作为一个辅因子参与细胞内许多生理生化过程，如DNA复制、ATP合成和神经递质合成等。在视网膜细胞中，铁离子参与脂肪酸去饱和酶［1］、鸟苷酸环化酶［2］和含铁蛋白酶 RPE65［3］等多种酶的合成。视网膜中过量的铁离子具有毒性作用，铁的自由基产物可引起严重的细胞氧化损伤。大量研究已证实铁超载与眼铁质沉着症、AMD、血色素沉着病等疾病密切相关。

1 视网膜组织内铁离子转运与分布

视网膜毛细血管和视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelium，RPE)细胞组成血-视网膜屏障。血液循环中的铁与转铁蛋白复合物经细胞表面转铁蛋白受体(transferrin receptors，TfR)介导的内吞作用进入细胞［4］。

血清转铁蛋白(transferrin，Tf)运载 Fe3+与细胞膜上的TfR结合，通过 TfR介导的内吞作用形成内吞小体，Src激酶可调控这个内吞过程［5］。由于内吞小体膜上H+泵的作用使内吞小体内pH下降，这导致Fe3+与 Tf解离，还原为 Fe2+并释放回细胞液中［6］。在大多数细胞中，二价金属离子转运蛋白1(divalent metal transporter 1，DMT1)参与铁从内吞小体的Tf上释放的跨膜转运过程。大部分Tf-TfR复合物经囊泡外排回到细胞血管腔侧膜表面，Tf与TfR解离重新回到血液循环中。而进入细胞内的铁可能以Fe2+的形式继续跨越另一侧细胞膜入组织，但这一过程的分子机制目前所知甚少。已有研究发现膜铁转运蛋白1(ferroportin1，FPN1)/膜铁转运辅助蛋白(海帕西啶，hepcidin)系统和非海帕西啶依赖性铁转运系统(FPN1/ceruloplasmin，FPN1/CP)在铁跨越小肠上皮细胞基底膜的过程中起关键作用，而FPN1在视网膜内分布较为广泛。

在视网膜中，铁蛋白见于光感受器细胞内节、RPE、内核层和神经节细胞层中，Yefimova等［7］对铁离子与相关蛋白在鼠视网膜细胞内的分布进行实验研究，发现铁和铁蛋白在RPE细胞和光感受器细胞内节浓度最高，外节相对较低，铁的含量与铁蛋白的含量呈正相关。铁蛋白与铁离子结合紧密，可调节新生血管的产生［8］，且与 p53 蛋白相互作用［9］，在一定程度上防止铁离子发生氧化应激。RPE细胞是视网膜合成Tf的主要场所，免疫组织化学发现TfR1存在于神经节细胞层、内核层、外丛状层、光感受器的内节和RPE细胞内，TfR2仅见于RPE细胞，两种受体均存在于RPE细胞基底膜。Hunt等［10］在人RPE细胞顶部和基底部发现TfR，这可能与铁离子直接穿过RPE进入视细胞有关。Hawkins［11］发现玻璃体内含有大量的 Tf，Laicine等［12］研究证明玻璃体内至少部分的Tf是由眼球自身的细胞合成的。DMT1可见于双极细胞体及轴突末端、水平细胞体和光感受器细胞胞体［13］。Burdo等［14］培养牛 RPE 细胞发现通过血-视网膜屏障的铁离子的量是由RPE细胞内的铁离子浓度决定的。

2 视网膜细胞内铁的调节

视网膜细胞中铁离子代谢的相关分子主要有铁蛋白、Tf、TfR、DMT1、FPN1、海帕西啶、铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP)等。近几年研究证明视网膜细胞可表达多种基因维持自身铁代谢平衡，包括HLA相关蛋白 HFE［15］、TfR2［16］、FPN1［17］、海帕西啶［18］和 HJV(haemojuvelin)［19］。

海帕西啶为肝细胞合成和分泌的铁代谢调节肽激素，是与CP同源的含铜蛋白。海帕西啶具有亚铁氧化酶活性［20］，通过将Fe2+氧化为Fe3+辅助铁的输出。早期对转基因小鼠进行实验研究发现，海帕西啶基因缺失导致小鼠多个脏器组织发生严重的铁超载，过表达海帕西啶基因则导致大多数小鼠在出生后不久便死亡，存活下来的小鼠也出现了严重的铁缺乏和低色素性小红细胞性贫血症状。Gnana-Prakasam等［21］通过一系列实验证实，海帕西啶调节铁稳态是通过其在机体中结合FPN1并且下调FPN1水平来实现的。海帕西啶广泛分布于视网膜细胞，其中Mülle胶质细胞和光感受器细胞可表达海帕西啶。尚未证明RPE细胞能直接表达海帕西啶，血液循环中的海帕西啶与FPN1结合共同参与RPE细胞内铁离子转运［22-23］。在CP和海帕西啶基因双敲除的小鼠中，视网膜出现铁沉积并且退化［24］，提示海帕西啶在视网膜铁调节中至关重要。

FPN1是目前发现的唯一的跨膜铁输出蛋白［25］。研究表明，FPN1在亚铁氧化酶 CP或海帕西啶的辅助作用下，将Fe2+转运出肠吸收细胞的基底面，并且直接参与巨噬细胞铁的释放。研究发现在鼠视网膜中，FPN1基因广泛表达于RPE基底部、光感受器细胞的内节、内外丛状层和神经节细胞层。

HFE与β2微球蛋白结合，下调TfR和海帕西啶的浓度，HJV也参与调节细胞内海帕西啶浓度。在视网膜中，HFE仅分布于RPE细胞基底部，HJV表达于RPE细胞顶部、Mülle胶质细胞、光感受器细胞和神经节细胞。

3 视网膜细胞内铁超载与铁毒性

3.1 铁毒性的机制 尽管铁在细胞中有着严格的调节机制维持铁稳态，但随着铁沉积的加重，多余铁可导致细胞的损伤。铁毒性作用主要基于Fenton化学作用:铁与过氧化氢、超氧阴离子等活性氧中间物发生反应，产生活性氧自由基如羟自由基。这些分子可以引起一系列的级联反应进而破坏细胞的磷脂膜、蛋白质和核酸等，引起细胞病变造成细胞损伤甚至死亡。视网膜高氧代谢、长期的吞噬、高浓度的多不饱和脂肪酸、光照暴露都为氧化应激提供了理想的环境。外层视网膜尤其是光感受器外节的胞膜上含有高浓度的多不饱和脂肪酸，且此处氧分压接近于动脉血的氧分压，因此多不饱和脂肪酸极易被氧及其衍生物所氧化［26］。

3.2 铁与年龄相关性黄斑变性 年龄相关性黄斑变性(AMD)已经成为中老年人群主要的眼部疾病。尽管AMD被公认为是一个多因素疾病，具体病因不明，在它的发展过程中，氧化应激仍具有重要的作用。国外一项年龄相关性疾病研究结果显示口服抗氧化剂和锌可以显著延缓AMD的进展［27］。虽然引起AMD氧化应激的具体因素还不清楚，但在死后AMD患者的视网膜中见大量铁沉积［28］，RPE细胞、Bruch膜和玻璃膜疣上可见大量的铁螯合物［29］。研究发现 AMD患者的Tf浓度明显升高［30］，黄斑区铁含量随年龄增加而增加［31］。CP和海帕西啶基因双敲除的小鼠因为铁超载出现RPF内物质沉积及视网膜下新生血管等类似AMD的视网膜变性。这些都证明铁超载与AMD密切相关，有报道称磷酸脂酶A2在铁超载引起的视网膜变性中发挥重要作用［32］。

阿尔茨海默病［33］和心血管疾病［34］在进程与发展中都存在着铁调节机制的破坏，这两者在流行病学上与AMD有着密切联系。炎症因子也参与这些疾病的发展，铁与炎性反应可能调节细胞中海帕西啶浓度，引起组织内铁沉积。

3.3 铁与遗传性视网膜疾病 低铜蓝蛋白血症、血色素沉着病、泛酸激酶相关神经退行性病变等遗传性疾病均可引起视网膜细胞内铁沉积，从而造成视网膜退行性改变。

3.3.1 低铜蓝蛋白血症 低铜蓝蛋白血症是一种罕见的由血清CP基因突变引起的常染色体隐性遗传疾病，临床表现为糖尿病、视网膜和神经系统退行性变三主征。CP是一种主要由肝脏合成、分泌的蛋白，正常情况下是不能通过血-视网膜屏障进入视网膜组织内，CP可将 Fe2+氧化成Fe3+，并将其转运到血浆前转铁蛋白合成Tf，CP缺失则Tf不能利用铁或不能和铁结合，将导致铁离子在细胞中大量积聚。Yamaguchi等［35］对1例56岁低铜蓝蛋白血症患者进行检查，发现患者双眼视网膜发生退行性改变，FAA提示后极部病损区视网膜血流障碍，EGG出现a波、b波波幅下降。CP基因敲除的小鼠视网膜下生成新生血管，光感受器细胞发生退行性改变，外节出现铁沉积，RPE细胞增生、肥大、坏死并伴随铁沉积［25］。

3.3.2 血色素沉着病 大多数血色素沉着病是由HFE基因突变引起的器官组织铁质沉着。正常HFE蛋白与TfR1结合，降低TfR和 Tf亲和力，减少铁离子向细胞内转运。少部分血色素沉着病是由FPN1、HJV、TfR2和海帕西啶基因突变引起［36］。FPN1突变可降低细胞排出铁离子、HFE、HJV、TfR2，海帕西啶基因突变可导致细胞内海帕西啶调节障碍，这些调节失衡导致细胞组织中铁沉积。Roth等［37］发现原发性血色素沉着病患者的视盘周围的RPE细胞、睫状体上皮细胞和巩膜均有铁沉积，并且出现玻璃膜疣。海帕西啶基因敲除的大鼠出现RPE细胞增生肥大等类似视网膜铁沉积的病理改变。

3.4 铁离子与感染性视网膜疾病 炎性反应可引起肝细胞大量表达海帕西啶，降低血液中铁离子浓度，减少病原体生长繁殖。研究发现玻璃体内注射细菌胞壁脂多糖引起视网膜大量表达海帕西啶，且脂多糖可调节 Müller胶质细胞和 RPE细胞表达海帕西啶［15］，Müller胶质细胞、光感受器细胞和 RPE细胞内FPN1浓度降低。脂多糖诱发视网膜细胞发生氧化应激反应，尤其在内外核层，所以慢性视网膜细菌感染破坏视网膜铁离子平衡，引起视网膜损伤。

免疫缺陷的患者容易感染巨细胞病毒引发视网膜炎［38］。患者感染巨细胞病毒，一方面通过降低细胞HFE的表达，使胞内铁离子浓度增加，加快病毒复制;另一方面由于RPE细胞内TfR1水平降低伴铁蛋白增加，出现铁沉积，进一步发生脂质氧化应激反应，造成细胞损害。

4 总结

视网膜内铁代谢失衡是导致视网膜退行性疾病发病的重要原因之一。视网膜内铁的摄取、转运、输出等环节都受到非常严格的调控，各种铁代谢相关蛋白相互协作共同维持着视网膜内铁稳态。随着研究的不断深入，特别是对铁代谢相关蛋白基因的研究，为探索视网膜内铁代谢具体机制提供了很好的切入点，为研究和治疗铁代谢失衡导致的疾病提供更多的理论依据。

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