HDACs及HDAC3与胶质瘤的相关性研究进展

朱 晋，姜 涛(综述)，万 虹，张玉琪(审校)

(1.首都医科大学附属北京天坛医院神经外科，北京 100050； 2.北京市神经外科研究所，北京 100050；3.清华大学玉泉医院神经外科，北京100049)

胶质瘤是中枢神经系统常见的侵袭性肿瘤，占颅内原发肿瘤的50%～60%。虽然目前胶质瘤有许多治疗方法，如手术、化疗、放疗、生物治疗等，但临床预后仍差，伴有较高的病死率，尤其是儿童患者[1]。研究发现，在恶性胶质瘤中存在很多基因变异，包括癌基因(ras、raf)和抑癌基因(p53、磷酸酯酶与张力蛋白同源物)[2]。此外，还存在有表观遗传学的改变。表观遗传学有两种经典的调节基因表达方式：组蛋白修饰及DNA甲基化。其中，已发现组蛋白修饰有乙酰化、甲基化、磷酸化等60余种，组蛋白乙酰化与甲基化修饰的研究较多。

在真核生物，分子领域的乙酰化和去乙酰化平衡对于保持基因转录和不同细胞蛋白的生物学作用是至关重要的。如组蛋白的乙酰化作用被乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)所调控，这在从酵母菌到人类都是很保守的[3]；HAT将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，HDACs使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。

1 HDACs的发现、鉴定与分类

1996年曾经关于HDACs的研究成为热点，科学家提纯和克隆了第一个人类HDACs：HDAC1(简称HD1)[4]。随后在同一年发现了一种转录共抑制蛋白(即HDAC2)，它是与酵母菌RPD3高度同源的转录因子，通过对人类YY1转录因子的酵母双杂交实验所识别[5]。紧接着，另一种人类HDACs，HDAC3被发现。通过检索北卡罗莱纳大学医学协会关于表达片段的数据库发现HDAC3类似于酵母菌RPD3[6]。

HDACs在真核生物致癌，在细胞周期阻滞、细胞凋亡、恶性疾病的病理分级等方面发挥着重要的作用[7]。影响着染色质的包装，继而影响了转录活性。强乙酰化作用往往有着较高的转录活性，而弱乙酰化作用则有着较低的转录活性。

根据它们与酵母HDACs的同源性差异，可以将人类HDACs分为4类：①CLASSⅠ接近于酵母菌转录控制因子RPD3，包括HDAC1、2、3、8，主要存在于细胞核内。这类酶类与其他蛋白质形成复合物发挥作用[8]。②CLASSⅡ与酵母菌转录控制因子Hda1具有同源性，包括HDAC4、5、6、7、9、10，其根据催化区域的不同又可分为两类：CLASSⅡA有一段催化区域，包括HDAC4、5、7、9；CLASSⅡB有两段催化区域，包括HDAC6、10。它们在细胞核以及细胞质内均有表达，可能影响细胞核外的非组蛋白基质乙酰化状态。在骨骼肌、心脏、脑组织以及低有丝分裂活性的组织表达很高[9]。以上两种酶类有一个共同的酶促机制，即锌离子催化的乙酰基赖氨酸酰胺键水解反应。③CLASSⅢ由Sirtuins (SIRT)蛋白1～7组成，类似于酵母菌Sir2蛋白,它们需要依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)以维持去乙酰化活性，这一点与CLASSⅠ和 CLASSⅡ HDACs依赖锌离子催化机制是相反的[10]。④另外还有一种在高级别真核生物中锌离子依赖去乙酰化酶类(哺乳动物中的HDAC11)，这种类型明显区别CLASSⅠ和Ⅱ HDACs，为此专门分为一类[11]。

2 HDAC3的酶反应底物及组蛋白底物

HDAC3自身的重组体并没有组蛋白去乙酰化作用，HDAC3必须被TCP-1(t复合多肽1)换装复合体合适的折叠，然后与核受体辅阻遏子或沉默维甲酸和甲状腺激素受体的中介绑定形成一个活性酶复合物才能发挥生物学作用[12]。至少在HeLa细胞中，细胞的HDAC3大部分发现与SMRT和NCoR复合体有联系。NCoR和SMRT与无配体的TR和RAR有联系，调节它们的抑制作用[13]。

HDAC3与NCoR/SMRT的复合物已经被发现通过两种途径抑制转录：第一种是乙酰基的移除增加了组蛋白末端与带负电的DNA主链的亲和力，这也导致了染色体构成关闭难以进行转录。第二种是组蛋白去乙酰化减少了bromo结构域辅激活剂的招募，如染色质相关蛋白及特异结合在乙酰基赖氨酸亚基上提高转录活性的组蛋白HAT[14]。HDAC3/NCoR/SMRT介导无配体的核受体的抑制，如PPAR、RAR、RXR、GR、NR4A2和Rev-Erb[15]。当配体结合HDAC3就丧失了抑制作用，导致构象的改变，松解辅阻抑物复合体，使辅激活物与之结合。

有一些研究旨在识别HDAC3优先结合的组蛋白尾部赖氨酸残基，但是得到的结论很有争议。第一种说法是HDAC3有效地参与组蛋白H3和H4的去乙酰化作用，但是结果只是HDAC3比HDAC1有更完全的去乙酰化作用[7]。相反，Hildmann等[7]发现SMRT/NCoR复合物的组蛋白去乙酰化更倾向作用于组蛋白H3。更多的研究者想明确组蛋白尾端的赖氨酸基通过HDAC3如何起作用。一项体外实验提示，HDAC3使H2AK5、H4K5和H4K12彻底去乙酰化，但是部分去乙酰化H3、H2B、H4K8和H4K16[16]。其他的基因剔除模型和药理抑制实验支持组蛋白H4乙酰化位点作为HDAC3的作用靶点，增加了组蛋白H3K9/K14乙酰化水平[17]。HDAC3去乙酰化与一些互补酶类(如甲基转移酶等)协同发生作用以调节表观遗传修饰。

3 HDAC3的非组蛋白底物

值得注意的是，HDACs在非组蛋白的乙酰化构成中也很活跃，如核因子κB蛋白RelA。核因子κB是形成长期记忆的必须基因所需的转录因子。HDAC3已经被证明通过去乙酰化RelA导致HDAC3由核内向外转移[18]。干扰HDAC3可以扩大依赖核因子κB的转录，促进长期记忆的形成。另外一种非组蛋白底物是促肌细胞形成因子2(myocyte enhancer factor 2，MEF2)，一种对于结构可塑性基因调控非常重要的转录因子。HDAC4和其他的CLASSⅡA HDACs被证实都可以抑制依赖MEF2的转录过程，但它们对MED2D却几乎没有去乙酰化作用,只有HDAC3在体内外均能有效的对MEF2去乙酰化。HDAC3与MEF2在一个DNA结合域上有物理性的联系，这与其他CLASSⅡA HDACs是不同的[19]。HDAC3对于MEF2的去乙酰化终止了可塑性基因的转录。

此外，HDAC3同样去乙酰化MEF2及其他蛋白的PCAF和p300/CBPHAT。NCoR-HDAC3复合体被证明直接与CBP相互作用，增加的NCoR的浓度直接导致CBP HAT活性的减弱[20]。这些共同激活剂的去乙酰化，包括组蛋白HAT，被证实抑制了它们的作用和通路的活性。

4 HDACs的表达在胶质瘤发生、发展中的作用

HDAC3在全身的许多组织中都发现有表达，包括脑组织[21]。它是在人脑组织中表达最高的CLASSⅠHDACs类，尤其在海马、皮质和小脑中表达量更高。主要位于细胞核内，但是在胞质以及浆膜上也发现有表达[22]。

Lucio-Eterovic等[23]研究发现，与低级别星形细胞瘤、正常脑组织相比，在高级别星形细胞瘤中CLASSⅡ和Ⅳ HDACs mRNA水平在胶质母细胞瘤中的表达下降。而且，组蛋白H3乙酰化水平明显增高。

Milde等[24]发现与低级别髓母细胞瘤相比，HDAC5和HDAC9在高级别髓母细胞瘤中明显表达上调，并且表达量与生存期呈反比。

然而人们对HDAC3作用的研究不尽一致，Liby等[25]发现在人星形细胞瘤中HDAC3随着肿瘤恶性程度增高而表达增高，HDAC3可能是胶质瘤细胞增殖所必须的，在胶质瘤细胞的恶性转化和生长过程发挥了重要的作用。但是Campos等[26]发现在星形细胞瘤细胞中HDAC1、HDAC2和NCOR2有很强的核内表达，NCOR1和HDAC3在肿瘤细胞核内和胞质内弱表达，HDAC3表达量与肿瘤分级呈负相关，增高的HDAC3表达量与延长的生存期相关。

Kim等[27]发现在胶质瘤G6细胞中，抑制HDAC的表达可诱导褪黑素MT1受体和MeCP2蛋白的表达，从而参与胶质瘤细胞的表观遗传学。在小鼠胶质瘤模型中，应用抑制剂抑制HDAC3的表达，可以明显减弱成瘤能力，减弱增殖和血管生成，增加凋亡率，延长带瘤小鼠的生存期[28]。Sawa等[29]阐明HDAC可以促进胶质瘤母细胞系的血管内皮生长因子的产生和积聚，从而促进胶质瘤血管的生成。还有学者发现，HDAC3可以调节胶质细胞原纤维酸性蛋白的分泌和表达，减弱人类胶质瘤细胞间的间隙连接[30]。

关于HDAC3的分子机制，研究较少，但是人们已经证实它能够修饰的目的蛋白有p53、p73、E2F1、c-JUN等，乙酰化修饰对这些蛋白分子功能及稳定性的影响正成为研究的热点[31]。HDAC3参与人胶质瘤的具体机制虽然还不明确，但是可以肯定的它是肿瘤细胞所必不可少的一种调节分子，参与胶质瘤的主要生物学特性。

5 HDAC抑制剂

HDAC抑制剂(HDACis)是新兴的抗肿瘤药物，是各种肿瘤治疗研究的热点。HDACi根据其化学结构基本上可分为6类。小分子氧肟酸盐类，如曲古抑菌素A、SAHA、LAQ-824、LBH-589、PCI24789，主要作用于Ⅰ型和Ⅱ型HDACs；短链脂肪酸类，如丙戊酸、苯丁酸钠、丁酸钠，主要作用于Ⅰ型和Ⅱa型HDACs；苯甲酰胺类，如M5-275(主要作用于HDAC1、2、3)、MGCD0103(主要作用于Ⅰ型HDACs)；环形肽类，如曲古菌素A(主要作用于Ⅰ型和Ⅲ型HDACs)、环四肽(主要作用于Ⅰ型和Ⅱa型HDACs)、缩酚酸肽/FK-228(主要作用于Ⅰ型HDACs)；其他两类为环氧酮类(环四肽B)和杂化分子(CHAP31、CHAP50)[32]。

HDACis抗肿瘤机制包括阻滞细胞周期和促进细胞分化诱导细胞凋亡抑制血管生成等，能使多种肿瘤细胞的增殖抑制和凋亡增加[33-34]。在胶质瘤中，HDACis与放化疗联合应用治疗胶质母细胞瘤。有些专家认为,HDACis针对胶质母细胞具有放射增敏性作用[35]。可能通过细胞周期阻滞和促进细胞凋亡抑制胶质瘤细胞生长[36]。如Svechnikova等[37]将Trichostatin A和4-phenylbutyrate作用于人类胶质母细胞瘤细胞系GBM-29、U-343 MG、U-343 MGa Cl.2∶6，发现HDACi可以有效地促进这三种胶质母细胞瘤细胞的凋亡。

丙戊酸作为一种HDACs抑制剂，已经被报道可导致胶质瘤的细胞凋亡。个体耐受量应用于小儿高级别胶质瘤和弥漫性脑桥内胶质瘤是很安全的[38]。邵翠杰等[39]发现，丙戊酸能够抑制胶质瘤细胞的增殖，导致细胞周期G0、G1/M期阻滞，从而发挥抗胶质瘤作用。Fu等[40]证明，丙戊酸可以诱导胶质瘤细胞的自噬从而克服肿瘤细胞对放疗和凋亡相关的化疗的影响，丙戊酸可能是通过激活信号通路ras/raf-1/MEK/ERK发挥作用的。

Yin等[41]证实，辛二酰苯胺异羟肟酸导致多形性胶质母细胞瘤细胞停滞在G2～M期。辛二酰苯胺异羟肟酸通过鼠的血脑屏障增加了乙酰基-H3和乙酰基-H4，有效地抑制了脑的多形性胶质母细胞瘤生长。此外，在人颚骨肿瘤、白血病、甲状腺癌、卵巢癌等很多肿瘤的研究中发现，抑制HDAC3可以明显的抑制肿瘤细胞的生长增殖和侵袭。

6 展 望

很多实验已经证明在肿瘤的发生、发展中HDACs起着很重要的作用，其中，HDAC3与人胶质瘤的恶性病理分级及预后有着很重要的联系。但是说法并不统一，这可能与研究者的侧重点、人的种属差异有关系。综合前人的研究成果，认为HDAC3与人类各种肿瘤的发生、发展有密切的联系，参与了肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡、迁移等功能，抑制后可以阻止肿瘤细胞的增殖和迁移，起到一定的治疗效果。但是，HDACs作用的具体分子机制仍有待深入研究。作为抗肿瘤药物，HDACis在各系统肿瘤的研究中已经有新的成果出现。而下一步工作重点是在胶质瘤中展开HDAC3及其抑制剂的研究，旨在发现其与胶质瘤细胞增殖、迁移、凋亡等生物学作用的关系。相信在今后的研究中会有更新的成果出现，为胶质瘤的基因治疗提供新的途径。

[1] Kramm CM,Wagner S,Van Gool S,etal.Improved survival after gross total resection of malignant gliomas in pediatric patients from the HIT-GBM studies[J].Anticancer Res,2006,26(58):3773-3779.

[2] Burgess R,Jenkins R,Zhang Z.Epigenetic changes in gliomas[J].Cancer Biol Ther,2008,7(9):1326-1334.

[3] Marks P,Rifkind RA,Richon VM,etal.Histone deacetylases and cancer:causes and therapies[J].Nat Rev Cancer,2001,1(3):194-202.

[4] Taunton J,Hassig CA,Schreiber SL.A mammalian histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p[J].Science,1996,272(5260):408-411.

[5] Yang WM,Inouye C,Zeng Y,etal.Transcriptional repression by YY1 is mediated by interaction with a mammalian homolog of the yeast global regulator RPD3[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1996,93(23):12845-12850.

[6] Yang WM,Yao YL,Sun JM,etal.Isolation and characterization of cDNAs corresponding to an additional member of the human histone deacetylase gene family[J].J Biol Chem,1997,272(44):28001-28007.

[7] Hildmann C,Riester D,Schwienhorst A.Histone deacetylases-an important class of cellular regulators with a variety of functions[J].Appl Microbiol Biotechnol,2007,75(3):487-497.

[8] de Ruijter AJ,van Gennip AH,Caron HN,etal.Histone deacetylases(HDACs):characterization of the classical HDAC family[J].Biochem J,2003,370(Pt 3):737-749.

[9] Verdin E,Dequiedt F,Kasler HG.Class Ⅱ histone deacetylases:versatile regulators[J].Trends Genet,2003,19(5):286-293.

[10] Marmorstein R.Structure and chemistry of the Sir2 family of NAD+-dependent histone/protein deactylases[J].Biochem Soc Trans,2004,32(Pt 6):904-909.

[11] Gao L,Cueto MA,Asselbergs F,etal.Cloning and functional characterization of HDAC11,a novel member of the human histone deacetylase family[J].J Biol Chem,2002,277(28):25748-25755.

[12] Guenther MG,Yu J,Kao GD,etal.Assembly of the SMRT-histone deacetylase 3 repression complex requires the TCP-1 ring complex[J].Genes Dev,2002,16(24):3130-3135.

[13] Horlein AJ,Naar AM,Heinzel T,etal.Ligand-independent repression by the thyroid hormone receptor mediated by a nuclear receptor co-repressor[J].Nature,1995,377(6548):397-404.

[14] Zeng L,Zhou MM.Bromodomain:an acetyl-lysine binding domain[J].FEBS Lett,2002,513(1):124-128.

[15] Fajas L,Egler V,Reiter R,etal.The retinoblastoma-histone dea-cetylase 3 complex inhibits PPARgamma and adipocyte differentiation[J].Dev Cell,2002,3(6):903-910.

[16] Johnson CA,White DA,Lavender JS,etal.Human class I histone deacetylase complexes show enhanced catalytic activity in the presence of ATP and co-immunoprecipitate with the ATP-dependent cha-perone protein Hsp70[J].J Biol Chem,2002,277(11):9590-9597.

[17] Bhaskara S,Knutson SK,Jiang G,etal.Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability[J].Cancer Cell,2010,18(5):436-447.

[18] Chen LF,Fischle W,Verdin E,etal.Duration of nuclear NF-kappaB action regulated by reversible acetylation[J].Science,2001,293(5535):1653-1657.

[19] Grégoire S,Xiao L,Nie J,etal.Histone deacetylase 3 interacts with and deacetylates myocyte enhancer factor 2[J].Mol Cell Biol,2007,27(4):1280-1295.

[20] Cowger JJ,Torchia J.Direct association between the CREB-binding protein(CBP) and nuclear receptor corepressor (N-CoR) [J].Biochemistry,2006,45(44):13150-13162.

[21] Mahlknecht U,Hoelzer D,Bucala R,etal.Cloning and characterization of the murine histone deacetylase (HDAC3)[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,263(2):482-490.

[22] Longworth MS,Laimins LA.Histone deacetylase 3 localizes to the plasma membrane and is a substrate of Src[J].Oncogene,2006,25(32):4495-500.

[23] Lucio-Eterovic AK,Cortez MA,Valera ET,etal.Differential expression of 12 histone deacetylase (HDAC) genes in astrocytomas and normal brain tissue:class Ⅱ and Ⅳ are hypoexpressed in glioblastomas[J].BMC Cancer,2008,8:243.

[24] Milde T,Oehme I,Korshunov A,etal.Histone deacetylases 5 and 9 in medulloblastoma:novel markers for risk stratification and role in tumor cell growth[J].Clin Cancer Res，2010,16(12):3240-3252.

[25] Liby P,Kostrouchová M,Pohludka M,etal.Elevated and Deregulated Expression of HDAC3 in human astrocytic glial tumours[J].Folia Biol,2006,52(1/2):21-33.

[26] Campos B,Bermejo JL,Han L,etal.Expression of nuclear receptor corepressors and class Ⅰ histone deacetylases in astrocytic gliomas[J].Cancer Sci,2011,102(2):387-392.

[27] Kim B,Rincón Castro LM,Jawed S,etal.Clinically relevant concentrations of valproic acid modulate melatonin MT(1)receptor,HDAC and MeCP2 mRNA expression in C6 glioma cells[J].Eur J Pharmacol,2008,589(1/3):45-48.

[28] Wei L,Hong S,Yoon Y,etal.Early prediction of response to Vorinostat in an orthotopic rat glioma model[J].NMR Biomed,2012,25(9):1104-1111.

[29] Sawa H,Murakami H,Kumagai M,etal.Histone deacetylase inhibitor,FK228,induces apoptosis and suppresses cell proliferation of human glioblastoma cells in vitro and in vivo[J].Acta Neuropathol,2004,107(6):523-531.

[30] Asklund T,Appelskog IB,Ammerpohl O,etal.Histone deacetylase inhibitor 4-phenylbutyrate modulates glial fibrillary acidic protein and connexin 43 expression,and enhances gap-junction communication,in human glioblastoma cells[J].Eur J Cancer,2004,40(7):1073-1081.

[31] Di Gennaro E,Bruzzese F,Caraglia M,etal.Acetylation of proteins as novel target for antitumor therapy:review article[J].AminoAcids,2004,26(4):435-441.

[32] Mimeault M,Batra SK.New promising drug targets in cancer-and metastasis-initiating cells[J].Drug Discov Today，2010,15(9/10):354-364.

[33] Santini V,Gozzini A,Ferrari G.Histone dezcetylase inhibitors:molecular and biology activity as a premise to clinical application[J].Curr Drug Metab,2007,8(4):383-393.

[34] Marks PA,Breslow RD.Dimethyl sulfoxide to vorinostat:development of this histone deacetylase inhibitor as an anticancer drug[J].Nat Biotechnol,2007,25(1):84-90.

[35] Entin-Meer M,Yang X,VandenBerg SR,etal.In vivo efficacy of a novel histone eacetylase inhibitor in combination with radiation for the treatment of gliomas[J].Neuro Oncol,2007,9(2):82-88.

[36] Ugur HC,Ramakrishna N,Bello L,etal.Continuous intracranial administration of suberoy-lanilide hydroxamic acid (SAHA) inhibits tumor growth in an orthotopic glioma model[J].J Neurooncol,2007,83(3):267-275.

[37] Svechnikova I,Almqvist PM,Ekström TJ.HDAC inhibitors effectively induce cell type-specific differentiation in human glioblastoma cell lines of different origin[J].Int J Ooncol,2008,32(4):821-827.

[38] Wolff JE,Kramm C,Kortmann RD,etal.Valproic acid was welltolerated in heavily pretreated pediatricpatients with high-grade glioma[J].J Neurooncol,2008,90(3):309-314.

[39] 邵翠杰,陈芙蓉,关皑丽,等.丙戊酸对胶质瘤细胞株T98-G体外作用实验研究[J].中华神经外科杂志,2009,25(2):136-139.

[40] Fu J,Shao CJ,Chen FR,etal.Autophagy induced by valproic acid is associated with oxidative stress in glioma cell lines[J].Neuro Oncol,2010,12(4):328-340.

[41] Yin D,Ong JM,Hu J,etal.Suberoylanilide hydroxamic acid,a histone deacetylase inhibitor:effects on gene expression and growth of glioma cells in vitro and in vivo[J].Clin Cancer Res,2007,13(3):1045-1052.