细胞的缺氧信号转导通路

韩菲菲综述，陈国千审校

0 引 言

氧作为细胞内有氧呼吸电子传递链中的最终受体和某些酶类的作用底物，为维持人体各种细胞正常生命代谢所必需。在众多生理和病理状况下，一旦氧供应和消耗的任一环节出现异常，机体组织细胞氧缺乏信号立即通过氧感受器迅速传递至细胞核内，调节相关效应基因或蛋白的表达，并启动细胞缺氧诱导性反应［1］。

1 缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)通路

1.1 HIF 的结构及功能 Wang和 Semenza［2］在红细胞生成素基因的3'端发现一个由约50个核苷酸组成的增强子序列，随后在缺氧诱导的人宫颈癌细胞核抽取物中进一步发现一种通过这一序列起作用的转录因子即HIF。HIF是普遍存在于人和哺乳动物细胞内由α亚基(120 000)和β亚基(94 000)构成的异源二聚体，在调节细胞缺氧适应性反应中起着重要作用。β亚基又称芳香烃受体核转运子，作为结构性亚基在细胞内不受氧浓度影响而持续性表达。功能性α亚基作为HIF的活性亚基受缺氧信号的调控，含有的碱性螺旋-环-螺旋/PAS结构域，是其形成异源二聚体及与DNA结合所必需的分子结构［3］。在常氧(21%O2)条件下，α亚基在不断合成的同时又不断被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解，主要由其所含有的氧依赖降解结构域所介导。只有在细胞缺氧时α亚基降解受抑制而积聚增多，与β亚基结合形成有活性的HIF完整转录复合体并稳定表达。HIF的α亚基有HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α等3种，HIF-1α在所有组织中均有表达，而HIF-2α仅局限表达于肾小球内皮细胞、肝细胞、海马区内皮细胞;HIF-1α和HIF-2α为缺氧诱导型基因的潜在激活子，能特异性诱导某些靶基因的表达，如HIF-1α诱导磷酸甘油酸激酶-1参与能量的新陈代谢，HIF-2α诱导关键蛋白Oct4维持胚胎干细胞的多功能性;HIF-1α抑制c-myc癌基因的转录，而HIF-2α则与c-myc癌基因作用促进细胞增殖［4］。HIF-3α是一个负调节蛋白，在细胞缺氧时HIF-3α通过选择性剪接形成含抑制性PAS结构域的蛋白，与HIF-1α结合形成没有活性功能的HIF复合物［5］。

1.2 HIF的调控机制 细胞缺氧反应本质是细胞内一系列氧感受器感受细胞内外氧分压的变化，传导氧应激信号并引起细胞生物功能的改变。目前认为参与HIF调控的细胞氧感受器主要有脯氨酸羟化酶、Siah2、天冬氨酸羟化酶、线粒体等［6］。

近年研究表明，HIF-1α翻译后的磷酸化、羟基化、SUMO化、乙酰化、泛素化等修饰在调节其稳定和活性中起着重要作用［4］。氧依赖的脯氨酸羟化酶(prolyl-hydroxylase，PHD)与 α-酮戊二酸、Fe2+、O2等辅因子结合，羟化HIF-1α中特定的脯氨酰残基，羟基化的HIF-α被pVHL蛋白(von Hippel-Lindau protein)识别和捕获，pVHL则结合延长因子B、延长因子C、Cullin-2、Rbx1形成泛素连接酶复合体后介导 HIF-1α 泛素化，随后被蛋白酶迅速降解［7－8］。氧依赖的PHD介导HIF-1α羟基化是HIF-1α泛素化降解的关键基础，而HIF-1α的泛素化是其羟基化的后续效应。PHD作为细胞氧感受器对低氧极为敏感，当细胞氧浓度降到1%时可引起PHD酶活性下降到50%，因此，缺氧能抑制HIF-1α的羟基化使其稳定表达不被降解，从而与靶基因启动子区域的缺氧反应元件相结合，诱导缺氧靶基因的反式激活，调控一系列效应基因的转录与表达［9］，如红细胞生成素、糖酵解相关酶、葡萄糖转运蛋白1、血管内皮生长因子、诱导型一氧化氮合酶、热休克蛋白、血红素氧化酶1等。

果蝇Sina基因在哺乳动物中表达的同源蛋白物Siah2是一种泛素连接酶E3，在其N端有环指结构域，且每一环指结构域连有两个锌离子。Siah2活性依赖于环指结构域，并通过其与泛素结合酶E2相连［10］。当细胞处于缺氧环境时可诱导Siah2的表达和活性水平显著上调，导致PHD降解而减少，HIF-1α稳定性增加［11］。SPRY2也是 Siah2可降解底物之一，所有的SPRY蛋白在C端有一个高度保守的富含半胱氨酸的结构域，又是酪氨酸激酶的负性调节因子;缺氧诱导的Siah2其环指结构域与SPRY2结合引起SPRY2的蛋白酶体降解及Ras-ERK激酶途径的激活，从而调节肿瘤生长和转移［10］。

天冬酰胺酰羟化酶或称天冬氨酸羟化酶，又称为缺氧诱导因子抑制因子(factor inhibiting HIF，FIH)。FIH蛋白氨基酸序列在哺乳动物中具有高度保守性且广泛分布于各组织器官，是α-酮戊二酸、Fe2+、O2依赖的加氧酶。作为一种细胞氧感受器，FIH能够感受较大范围氧张力并负性调节HIF活性。研究显示，FIH可利用氧分子中1个氧原子使HIF-1α反式激活区域的关键性天冬酰胺残基Asn803羟基化，阻止反式激活区与转录共激活因子p300之间的结合［12］。另外FIH与pVHL结合形成的复合物，通过募集组氨酸脱乙酰基酶抑制HIF-1α的转录激活活性［6］。有学者发现，细胞在缺氧条件下Siah表达增加可促使FIH泛素化降解，进而通过上调PHD3表达水平间接影响HIF-1α稳定性［11］。

在缺氧条件下，线粒体通过释放产生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)起感受细胞内外氧分压变化。ROS为超氧阴离子、过氧化氢、一氧化氮、羟基自由基等单电子还原产物的总称，是细胞代谢过程中不可避免的产物，可高活性氧化细胞内生物大分子物质。诸多研究显示，ROS还可作为信号分子激活3-磷酸肌醇激酶、蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)等，参与调控多种缺氧相关转录因子(包括HIF)的信号转导通路［13］。将细胞放置于缺氧环境数小时后，使用活性氧特异探针2'7'-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(2'7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)检测显示，线粒体在缺氧条件下使细胞内ROS释放量增加，从而抑制PHD的活性及HIF-1α的降解，但在RHO0、ρ0等缺失线粒体DNA的细胞中，由于呼吸链电子传递功能障碍而抑制ROS产生，因而影响缺氧条件下HIF-1 的稳定［14］。

2 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白通路

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种进化十分保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长、增殖、分化、细胞周期调控等多个方面起到重要作用。活化的mTOR通过磷酸化某些翻译因子参与多种细胞功能如蛋白质的翻译合成，其最主要的下游效应蛋白是S6核糖体蛋白激酶和4E结合蛋白1［15］。TSC1/TSC2蛋白复合物是mTOR信号通路的重要负调节蛋白，在缺氧情况下，由REDD1(发育及DNA损伤反应调节基因1)所介导的TSC1/TSC2蛋白复合物磷酸化可下调mTOR表达水平，减少蛋白翻译合成、抑制细胞生长［16］。

3 内质网应激通路

在缺氧、氧化应激、异常糖基化反应及钙离子稳态失衡等情况下，内质网中未折叠蛋白增多、错误折叠蛋白积聚，当超出内质网的处理能力时可引起内质网应激适应性反应，继而降低内质网负担并维持细胞正常功能。但当组织细胞长期处于重度缺氧条件时，可诱导内质网蛋白降解途径相关基因表达水平上调，加速未折叠或错误折叠蛋白的降解并启动细胞凋亡通路。缺氧通过蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)、肌醇需求酶-1(inositol-requiring enzyme-1，IRE-1)、活化转录因子6(activating transcription factor 6，ATF6)等3个关键的内质网跨膜蛋白诱导未折叠蛋白反应，缺氧诱导的活化蛋白激酶R样内质网激酶使真核翻译起始因子2瞬间磷酸化而抑制蛋白质的翻译合成，减少新生蛋白进入内质网管腔，避免内质网过度负荷［17］;而活化后的 IRE-1、ATE6提高编码内质网分子伴侣蛋白的基因转录活性，提高内质网转运、折叠、降解蛋白的能力;肌醇需求酶1的活化促进X-盒结合蛋白1(X-box binding protein 1，XBP1)前体mRNA的剪接和成熟，使用SiRNA抑制XBP1后显著增加在缺氧条件下的细胞凋亡率［18］。许多分子伴侣如GRP78、ORP150、GRP94等作为未折叠蛋白反应的一部分，均可受缺氧诱导［6］。

4 MAPKs通路

MAPKs是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，存在于大多数细胞内，其信号通路将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，引起细胞生物学反应，如细胞的增殖、分化、凋亡等。在哺乳动物细胞内存在着多条并行的MAPKs信号通路包括胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N terminal kinase，JNK)通路和p38 MAPK通路等，该信号通路的某些分子发生突变或其下游基因发生改变与诸多疾病的病理有关，如免疫功能异常、缺血/缺氧性疾病、肿瘤发生发展等［19］。Kostova 等［20］研究显示，缺氧诱导释放的炎症介质高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)可与胞膜受体RAGE结合激活p38、JNK及p42/p44等信号通路，继而通过纤溶酶激活基质金属蛋白酶，降解细胞外基质，促进肿瘤侵润、转移。

5 冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein，CIRP)通路

Sheikh等［21］最初在转录反应的研究中发现，当紫外线辐射引起DNA损伤时可诱导激活一种冷休克蛋白即CIRP，且具有紫外线剂量依赖性。CIRP是一种相对分子质量为18000的核蛋白，在哺乳动物的各种组织细胞核内持续低表达，进化中氨基酸序列保持高度保守。人和小鼠CIRP蛋白含有172个氨基酸，氨基末端含RNA识别基序(RRM)，羧基末端富含精氨酸-甘氨酸-甘氨酸(RGG)基序。缺失突变体研究显示RRM或RGG结构域均可独立介导CIRP向细胞质的应激颗粒迁移，而RGG结构域中精氨酸残基的甲基化作用是CIRP核浆转位并在应激颗粒中聚积所必需的［22］。在低温、渗透压应激、紫外线、缺血/缺氧等诸多应激条件下，CIRP被诱导表达后从细胞核迁移到胞质应激颗粒中，通过与其特异胞膜受体结合发挥一系列生物学效应。Wellmann等［23］研究表明，在HIF-1α缺陷的人白血病细胞系Z-33和HIF-1β缺陷的鼠细胞系Hepa-1 c4处于轻度缺氧(8%O2)和严重缺氧(1%O2)时，均诱导上调CIRP的转录水平。Qiang等［24］运用表面等离子共振分析显示释放到胞外的CIRP作为内源性损伤相关模式分子(Damage associated molecular pattern molecules，DAMPs)与 Toll样受体(toll-like receptor 4，TLR4)、髓样细胞分化因子-2(myeloid differential protein-2，MD-2)或TLR4-MD2复合物结合并激活应激反应。

6 缺氧诱导核转录因子的改变

6.1 核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)NF-κB是一类重要的转录激活因子，参与免疫、炎症、应激等反应及细胞凋亡的调控。NF-κB的N端含有一个核定位区域，负责与DNA结合、二聚体化和核易位［25］。细胞静息状态下NF-κB异源二聚体与其抑制性蛋白ⅠκB非共价结合，以无活性的三聚体复合物状态存在于细胞质中，NF-κB活化有赖于ⅠκB蛋白的泛素化和磷酸化。当细胞受到氧应激时激活ⅠκB激酶，导致细胞质NF-κB三聚体复合物中ⅠκB磷酸化和泛素化，进而被蛋白酶体途径降解从三聚体中解离出来，暴露出NF-κB异源二聚体易位信号和DNA结合位点，被激活的NF-κB发生核转位从而发挥转录调控作用［26－27］。细胞缺氧应答反应与NF-κB信号通路密切相关［25］。研究显示肿瘤局部低氧环境中PHD2表达水平下调，引起NF-κB活化，上调IL-8、血管生成素等基因的表达，引发肿瘤血管的新生和肿瘤生长增殖［28］。通过对 IκB 激酶-β-/-动物的研究表明，NF-κB 的活性对HIF-1α及其靶基因的表达是必要的。NF-κB的氧应激不仅可上调基因表达，也可与组蛋白去乙酰化酶HDAC2相互作用而下调单核细胞趋化蛋白1的基因表达水平［29］。

6.2 转录激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)AP-1是一类重要核转录因子，由Jun和Fos两大家族组成，Jun家族成员之间可形成同源二聚体，也可与Fos家族成员异源聚合，但Fos家族成员只能与Jun家族成员异源聚合。在基础条件下，AP-1的分子构成以Jun-Jun同源二聚体为主，其蛋白浓度和活性极低;当细胞受到刺激时，AP-1蛋白水平迅速升高，并转变为以Jun-Fos异源二聚体为主要形式，结合DNA和诱导转录的能力也随之升高。AP-1作为环境生物感受器能够被多种外界刺激如机械刺激、氧应激、致炎因子等激活，AP-1通过其蛋白中c-Jun的磷酸化而活化，Ser63、Ser73是c-Jun氨基端激活结构域的两个磷酸化位点，受控于MAPKs的c-Jun氨基末端激酶［30］。缺氧时，MAPKs通路激活，核易位的c-Jun氨基末端激酶与c-Jun的氨基端激活结构域形成复合物而使c-Jun特异性磷酸化，活化的AP-1可协同其它信号转导通路调控多种靶基因的转录表达，参与细胞的转化、增殖、分化、凋亡等多种生物学功能，与肿瘤侵袭转移也密切相关［6，30］。研究发现AP-1能作用于NF-κB的p65，并且两者的促细胞生长和转化活性均明显增强［31］。

7 展 望

在机体处于高原反应、无菌性损伤、感染性炎症、肿瘤等诸多缺血缺氧情况下，引起组织细胞缺氧反应的氧感受器和信号转导途径可因细胞的种类和缺氧时间的长短而不同。介导细胞缺氧诱导性反应的信号转导通路并不是孤立存在的，可能是在多因素调控下由相同或不同的氧感受信号转导途径相互协调、综合作用的结果。目前复杂而多样的缺氧感受机制研究正日益受到重视，将有助于揭示缺氧性疾病病理机制及为疾病防治提供新的思路和方法。

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