野生冬菇产病原拮抗物的工艺参数确定

韩启灿，霍光华，罗桂祥，胡殿民，张 宝，陈明辉

(江西农业大学 生物科学与工程学院/南昌市生物资源保护和利用重点实验室，江西 南昌 330045)

在畜禽养殖业中肠道疾病严重影响动物的生长与发育，为诱发幼崽高死亡率的主要原因。大肠杆菌(E.coli)和食源性金黄色葡萄球菌(S.aureus)分泌的肠毒素等是引起畜禽腹泻与食物中毒的主要原因之一[1]。目前，畜禽腹泻的主要治疗对策是在饲料中添加抗生素、化学合成药物等，然而该类药物长期使用已经造成了病原抗药性和生物富集[2]，开发绿色饲料添加剂已成为该领域的发展方向。双孢菇、白林地菇[3]、蜜环菌[4]、菌草灵芝[5]、榆耳[6]等野生大型真菌具广谱抗菌活性，某些用作饲料添加剂已展示出应用前景。本实验从56 种野生大型真菌中筛选到一株对S.aureus、E.coli 等病原菌具有强抑制活性的野生冬菇(Flammulina ssp)0612-9，进而探明了该菌株发酵生产抗菌物质的培养基组成、发酵条件和抗菌物质的提取条件，以提高其所产抗菌物质的产量。

1 材料和方法

1.1 菌株及培养基 56 种野生大型真菌的野生分离菌(具体名称略)、S.aureus、E.coli、白色念珠菌(M.albican)的标准菌株均由南昌市生物资源保护和利用重点实验室保存。马铃薯葡萄糖琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、种子液体培养基、发酵液体培养基[7]、发酵基础培养基(葡萄糖20 g、麸皮10 g、KH2PO43 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、维生素B1 0.1 g，加水至1 000 mL，pH 自然)均由本实验室配制。

1.2 筛选抗菌活性菌株 发酵液对病原菌的抑制活性试验按照文献[8]进行。

1.3 活性菌株发酵液效价的测定 以S.aureus 为指示菌，盐酸四环素(1 mg=1 000 U)为标准品，采用一剂量法测定浓缩5 倍发酵液的效价[9]。

1.4 抗菌活性物质的发酵生产条件

1.4.1 培养基组成优化 单因子法优选碳氮源：等量的常用碳氮源(碳源：蔗糖、葡萄糖、玉米粉、可溶性淀粉、甘露糖；氮源：麸皮、蛋白胨、酵母粉、硝酸铵、尿素)分别替换发酵基础培养基中的相应成分，进行发酵及其发酵液抗菌活性测定。响应面设计：单因素优化基础上，首先采用N=12 的Plackett-Burman 试验筛选出主因素，然后通过最陡爬坡试验逼近最大响应区域，最后采用中心组合试验设计及响应面分析对主因素作进一步优化。

1.4.2 摇瓶发酵条件优化 在上述发酵条件优化基础上，以摇床温度、发酵周期、培养基初始pH 值和接种量为考察因素，采用L16(45)的正交设计对野生冬菇生产抗菌物质的发酵条件作进一步的优化。

1.4.3 抗菌活性物质的提取条件 抗菌活性物质的稳定性：热稳定性、pH 稳定性和紫外照射稳定性试验方法参照文献[7]进行。抗菌活性物质提取剂选择试验方法参照文献[10]。

1.4.4 试验设计方案和计算 采用SASJMP9.0.2 软件进行试验设计和计算。

2 结果

2.1 广谱抗菌活性菌株的获得 本研究筛选到一株具广谱抗菌活性的野生冬菇0612-9，实验结果显示其发酵液对S.aureus、E.coli 及M.albican 的抑菌圈直径分别为23.26 mm、16.12 mm、19.70 mm，抑菌效果均属高度敏感。发酵液乙酸乙酯粗提物对S.aureus的MIC 为1.25 mg/mL；10 mg/mL 发酵液乙酸乙酯粗提物抑菌圈直径为20.48 mm，与同等浓度盐酸四环素(抑菌圈为21.04 mm)的抑菌效果相近(图1)。

2.2 发酵液的效价 以盐酸四环素对S.aureus 的抑菌圈直径校正值为纵坐标，盐酸四环素浓度对数值为横坐标绘制标准曲线(图2A)。标准曲线的回归方程为：Y=8.0976X-18.750，R2=0.980，其中Y 为抑菌圈直径的校正值(用250 ppm 的盐酸四环素来校正抑菌圈直径)，X 为盐酸四环素浓度的对数值(图2B)。

图1 野生冬菇菌株0612-9 发酵液的抗病菌活性检测Fig.1 Antibacterial activity of fermentation broth from Flammulina ssp strain 0612-9

图2 野生冬菇菌株0612-9 发酵液对S.aureus 的抑制效价Fig.2 Determination of inhibitory titer of fermentation liquid on S.aureus

经测定，野生冬菇发酵液抗S.aureus 的抑菌圈直径平均校正值为7.76 mm(发酵液与250 ppm 四环素分别形成的抑菌圈直径之差，即23.48 mm～15.72 mm)，代入标准曲线回归方程得到5 倍浓缩发酵液的相对效价为1 806.34 U/mL。

2.3 0612-9菌株发酵培养基碳、氮源筛选 以葡萄糖、麸皮汁作为发酵培养基的碳、氮源时，所得发酵液对S.aureus 的抑菌圈分别达到20.71 mm、20.43 mm，抑菌活性显著高于其他供试碳氮源(表1)，试验结果表明0612-9 菌株发酵生产抗菌物质的最佳碳、氮源分别为葡萄糖与麸皮汁。

2.4 显著因素的Plackett-Burman筛选 试验设计及结果见表2。对实验结果进行多元回归分析和方差拟合，获得抑菌圈直径(Y)与自变量的多元一次回归模型为：Y=17.15+3.238X1+0.367X2+1.168X3+0.44X4-1.705X5+0.337X6+0.65X7+0.895X8+0.643X9+0.397X10(X1马铃薯、X2葡萄糖、X3麸皮、X4KH2PO4、X5MgSO4·7H2O、X6接种量、X7转速、X8发酵周期、X9温度、X10装液量)。该模型拟合性评价表明，其决定系数R2为0.991，拟合性良好。

t 检验分析结果显示，该菌株发酵生产抗菌活性物质的极显著(置信度大于99 %)影响变量有马铃薯、MgSO4·7H2O，显著(95 %<置信度<99 %)影响变量为麸皮。其中马铃薯、麸皮为正效影响因素，MgSO4·7H2O 为负效影响因素。后续试验选择土豆、麸皮、MgSO4·7H2O 三因素作进一步优化。

表1 不同碳、氮源对抗菌活性的影响Table 1 Effect of different carbon and nitrogen sources on antibacterial activity

表2 N=12 PB 试验设计与结果(指示菌为S.aureus)Table 2 Plackett-Burman design and result(indicator bacteria:S.aureus)

2.5 最陡爬坡试验逼近最大响应值的响应区域 表3 显示，处理3 所得响应值最大，采用第3 次实验条件为响应面实验因素的中心水平点作进一步优化，其余因素取值为：葡萄糖30 g/L，KH2PO42 g/L、接种量10 mL/100 mL、转速180 r/min、温度28 ℃、装液量100 mL、发酵周期10 d。

表3 最陡爬坡试验设计及结果Table 3 Experimental design and results along the path of steepest ascent

2.6 中心组合试验优化发酵工艺 试验设计及结果见表4。拟合获得二次多元方程为：Y=23.391+0.683X1+0.788X3-0.696X5-0.479X1X3-0.281X1X5-0.181X3X5-0.861X12-0.813X32-0.970X52，其中Y 为抑菌圈直径。该二次多元回归方程的决定系数R2为0.9273，拟合性较好，所以该方程可用来预测和分析0612-9 菌株发酵产抗菌物质的活性强弱。回归分析显示，所有一次项与二次项对发酵液抗菌活性均有显著影响(p<0.05)(表5)，然而交互项影响均不显著，表明三因素之间交互作用相对较小。响应面及等高线图(图3)表明，响应曲面的顶点与等高线的中心点均在所选的因素水平内，表明该水平范围内存在极大值。计算可得：土豆为270.53 g/L，麸皮7.429 g/L，Mg-SO4·7H2O 0.4551 g/L 时取得最大响应值26.84 mm。

2.7 野生冬菇发酵条件的正交试验 表6 表明，四因素对野生冬菇发酵上清液的抗菌活性均有不同程度的影响，极差数值比较表明摇床温度影响最为显著，依次是接种量、发酵周期和培养基的初始pH值。水平极差分析结果表明野生冬菇摇瓶发酵产抗菌活性物质的最佳发酵培养条件组合是：摇床温度27 ℃、接种量5 %、发酵周期为11 d、培养基初始pH 值为4.0。

2.8 最优发酵工艺参数 综上所述，野生冬菇发酵生产抗菌物质的最佳发酵工艺参数为：土豆270.53 g/L，麸皮7.429 g/L，葡萄糖30 g/L，MgSO4·7H2O 0.4551 g/L，KH2PO42 g/L，培养基初始pH 值为4.0，发酵周期11 d，接种量5 mL/100 mL，转速180 r/min，摇床温度27 ℃，装液量100 mL/250 mL。

表4 中心组合试验设计及结果Table 4 Experimental design and result of central composite method

表5 中心组合模型的回归系数评价Table 5 Estimation of regression coefficients for central composite design model

图3 3 个主因素影响抗菌活性的响应面及等高线Fig.3 The response surface and contour curve for antibacterial effects of three main factors

2.9 抗菌活性物质提取

2.9.1 抗菌物质稳定性 为了能够控制抗菌物质提取过程中的条件，本实验研究了温度、pH 和紫外照射对发酵液中抗菌物质活性的影响，结果表明当温度达到80 ℃、pH>6.0 时抗菌物质显著失活，而该抗菌物质对紫外线照射不敏感(图4)。

表6 野生冬菇发酵条件正交试验结果Fig.6 The results of orthogonal test of the fermentation conditions of wild Flammulina ssp

图4 抗菌物质稳定性Fig.4 Stability of antimicrobial substance

2.9.2 抗菌物质提取剂的选择 表7 显示，发酵液的乙酸乙酯、正丁醇萃取相均表现出抑菌活性，而石油醚萃取相无抑菌活性。据相似相容原理，可大致判断该抗菌物质为中等极性。乙酸乙酯对发酵液抗菌成分的提取效果最佳，因此选用乙酸乙酯作为发酵上清液抗菌物的提取溶剂。菌丝体各萃取相均无抗菌活性，表明抗菌物质为胞外产物。

表7 液体发酵产物各萃取组分抑菌活性Table 7 Antibacterial activity of extracts from liquid fermentation product

3 讨论

真菌液体培养过程中，发酵液产生多糖、多肽、核酸、酶、甾醇、维生素及具有抗生素作用的多种化合物，其营养丰富，并且具有抗菌、抗癌、消炎、提高免疫等生物活性。目前，从药用大型真菌中探寻天然抗菌剂的研究也有报道。马慧妮等2006年研究表明多孔菌发酵液乙酸乙酯提取物能够显著抑制S.aureus、E.coli 和枯草芽孢杆菌[11]。

真菌冬菇的菌丝体含有较高的脂溶性维生素E，菌丝体干粉具有显著免疫活性，其发酵液和菌丝体含有必需氨基酸、微量元素等多种营养成分，可以开发为新型营养饮料、保健药、食品添加剂等，然而用作抗菌剂的研究鲜有报道。本研究筛选到一株具有广谱抗菌活性的野生冬菇0612-9，其发酵液的乙酸乙酯提取物对S.aureus 的MIC 为1.25 mg/mL，远小于辛英姬等研究所得茶树菇多糖对S.aureus 的MIC 值(6.25 mg/mL)[12]，表明本研究获得的野生冬菇对S.aureus 的抑制作用显著高于茶树菇多糖。该野生冬菇的5 倍浓缩发酵液与盐酸四环素活性相近，其抗S.aureus 的相对效价为1 806.34 U/mL，具有强抑菌效果，并且在低于60 ℃、pH1.0～6.0 和紫外照射下活性稳定，有望开发成为绿色饲料添加剂，以替代目前存在诸多缺点的兽用抗生素。

在微生物发酵代谢产物的研究中，发酵工艺优化起着举足轻重的作用。目前，通过响应面法优化生物反应过程的报道较多，大部分取得较好的优化结果。本研究采用响应面法与正交设计优化了野生冬菇0612-9 的发酵工艺，获得了最佳工艺参数。由于野生冬菇0612-9 菌体生物量与抗菌活性物质的积累不一致，主因素碳、氮源和矿物质的使用量直接影响到两者的增幅，因此本研究结果对在该抗菌物质放到生产中降低发酵成本和提高生产效率具有指导意义。

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