免疫组化法检测鸭源大肠杆菌O46分离株在人工感染鸭体内的动态分布

冉丹丹，于学辉，罗 薇，刘 飞，孙 吉，刘亚刚

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

免疫组化法检测鸭源大肠杆菌O46分离株在人工感染鸭体内的动态分布

冉丹丹，于学辉，罗 薇，刘 飞，孙 吉，刘亚刚*

(西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

为研究鸭源致病性大肠杆菌(E.coli）O46分离株感染雏鸭后在其体内组织器官中的动态分布，本实验将E.coliO46分离株经口服、肌注和皮下注射3种途经感染雏鸭，于感染后不同时间点采集雏鸭15个不同的组织器官制备组织切片，采用免疫组化染色方法，利用E.coliO46定型血清对样品中细菌抗原进行定位跟踪检测。结果显示：口服、肌注和皮下注射3种途经接种E.coliO46分离株后，15个不同的组织器官中除气管未检测到细菌抗原外，其余的组织器官均检测到细菌抗原。心脏、肺脏、脾脏、肾脏和肠道是感染的主要靶器官，并且抗原主要存在于其感染细胞的细胞质中，阳性信号最早出现于心脏。本研究表明鸭源E.coliO46分离株能够在鸭体内广泛的侵嗜增殖并造成鸭急性发病和死亡。

大肠杆菌O46分离株；免疫组化；感染雏鸭；动态分布

鸭大肠杆菌病是由鸭致病性大肠杆菌(E.coli）引起的一种急性败血性传染病，主要引起鸭的严重腹泻，影响鸭生长发育并引发死亡，鸭E.coli病已成为危害养鸭业最主要的细菌性传染病之一[1]。2008年，本实验室从成都某规模化养鸭场送检的患典型败血症的发病雏鸭中首次分离到血清型为O46的鸭致病性E.coli(以下称O46分离株），该分离株接种2周龄雏鸭100%致死，具有很强的致病性[2]。其毒力基因hlyA、eaeA、iss等检测均为阳性，并且hlyA基因与O157∶H7 Sakai序列同源性为100%，为一株携带多种毒力基因的鸭致病性E.coli[3]。间接免疫酶组化(Indirect immunoperoxidase staining，IIS）方法具有特异性强、敏感性高、便于直观等优点，因而近几年在国内外相关研究中得到广泛应用[4-5]，尤其是在检测E.coli方向[6-7]，本研究将O46分离株分别以不同途径感染10日龄的雏鸭，采用IIS方法检测其抗原在雏鸭体内的定位和动态分布，为研究鸭源E.coliO46分离株对机体的感染与致病机理提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 菌株、血清及实验动物 鸭致病性E.coliO46分离株(EF620923）由西南民族大学禽病研究所分离、鉴定和保存；鸭胚购自成都市新津种鸭场，自行孵化，隔离器内饲养至10日龄；E.coliO46定型血清购自中国兽医药品监察所，批号 9405；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(IgG-HRP）和DAB显色剂均购自华美生物工程公司；UltraSensitiveTM超敏浓缩试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2 实验设计 72只10日龄雏鸭随机分成4组，分别进行E.coliO46分离株的人工感染。感染剂量及途径见表1。接菌后2 h、4 h、12 h、24 h、36 h及72 h采集心、肝、脾、肺、肾、脑、气管、胸腺、十二指肠、空、回、盲、直肠、法氏囊及胰腺，每个时间点平行采集2只雏鸭，对死亡的雏鸭同样进行采样并检测病理变化，样品经4%多聚甲醛固定。同时平行采集对照组鸭的各器官样品。

1.3 I I S染色及结果判定 将实验鸭的心、肝及脾等组织按常规方法制备4 μm石蜡切片，脱蜡入水后进行抗原的修复，封闭组织内源性过氧化物酶，按照UltraSensitiveTM超敏浓缩试剂盒说明书方法，以E.coliO46定型血清(1∶50）为一抗，羊抗兔IgG-HRP(1∶150）为二抗，进行切片IIS染色，利用DAB显色剂进行切片显色。以正常健康鸭组织切片为阴性对照；O46分离株感染发病死亡的雏鸭各器官组织切片为阳性对照。显色结果按光学显微镜视野下观察到的特定细胞经染色后棕黄色显色的有无、数量、种类及深浅来判定：①组织胞浆中未出现棕黄色着色的判为阴性；②组织胞浆中棕黄色着色零星分布并且少于5%的判为弱阳性；③组织胞浆中棕黄色着色分布比例为5%～50%为阳性；④组织胞浆中棕黄色着色在总组织胞浆中分布比例大于50%为强阳性。

表1 人工感染试验Table 1 Artifical infection experiment

1.4E.c o l iO46分离株感染雏鸭组织内细菌分布的动态观察检测 利用IIS方法对采集的样品进行检测，通过显微镜观察，照相记录。

2 结 果

不同途径接种O46分离株雏鸭的各器官在不同时间采用IIS方法检测E.coli分布的结果见表2、表3和表4。其中，肝脏阳性信号在肝小叶间的结缔组织和肝索区、肝血窦区细胞质中呈散在分布；脾脏阳性信号主要位于白髓淋巴细胞胞质；肾脏阳性颗粒主要位于皮质区的间质和肾小球毛细血管基质细胞质中；心脏阳性信号主要分布在心肌膜心肌纤维的肌浆；胰腺阳性信号主要位于腺泡上皮细胞细胞质；胸腺髓质区的网状细胞和淋巴细胞质中均检测到阳性信号；肺脏阳性信号主要位于支气管腔的红细胞团块以及毛细血管中；大脑阳性信号主要分布在血管内皮细胞浆；法氏囊阳性颗粒主要分布在囊小结淋巴细胞胞质；十二指肠阳性颗粒主要分布在肠绒毛粘膜上皮细胞和肠腺上皮细胞；空、回、盲和直肠阳性颗粒主要分布在粘膜上皮细胞和肠腺上皮细胞；气管各时间点均未检测到细菌抗原。对照组各组织的检测结果均为阴性。部分脏器免疫组化阳性结果见图1。

不同途径接种E.coli均以心脏、肺脏及脾脏的阳性检出率最高。肌注组和皮下组2 h即可从心脏检测到阳性信号，口服组12 h才能够检测到阳性信号，24 h～72 h时3个组绝大部分样品均能够检测到阳性信号(图2）。

表2 肌注组各个时间点各组织IIS检测结果Table 2 IIS result of tissues for detection ofE.coliat different time after intramascular injection infected

表3 皮下组各个时间点各组织IIS检测结果Table 3 IIS result of tissues for detection ofE.coliat different time after subcutaneous injection infected

3 讨 论

实验动物感染E.coli后出现的特定致病现象可以为细菌在动物机体中定殖以及毒素对机体的作用等致病机理分析提供一定参考依据。本研究通过IIS方法观察了O46分离株在人工感染鸭体内的侵嗜过程。实验结果表明，O46分离株能够在实验鸭除气管外的所有器官组织中被检出，表明O46分离株在鸭体内能够进行大面积的侵嗜。阳性信号主要存在于单核巨嗜细胞系统的吞噬细胞浆内，于学辉对O46分离株超微病理学观察也表明受到感染的细胞主要有淋巴细胞、巨噬细胞[2]，这可能是由于E.coli进入体内后被吞噬细胞吞噬所致。细菌抗原阳性检出率是衡量细菌对该组织侵害性的重要指标，肌注组、皮下组和口服组均以心脏、肺脏和脾脏的阳性检出率最高，均出现极强阳性信号，这和于学辉对O46分离株超微病理观察的结果(在心脏、脾脏和脾脏中观察到E.coli）一致[2]，进一步表明心脏、肺脏和脾脏是O46分离株感染机体的主要靶器官。肾脏、回肠、直肠、十二指肠、空肠和盲肠等均出现阳性信号，表明O46分离株可以由接种部位到达主要内脏器官并对这些内脏器官造成损伤。在本实验中，肌注组2 h、皮下组4 h，口服组12 h可以在心脏心肌纤维的肌浆中检测到阳性信号。结合于学辉对O46分离株超微病理学观察[2]，接种后24 h在心肌血管中检测到细菌，36 h在心肌纤维中检测到细菌，48 h横纹两侧的肌元纤维出现溶解断裂，显示细菌在断裂处复制，进一步表明O46分离株感染机体的首要靶器官是心肌纤维，E.coli以心脏为主要靶器官为首次报道。另外，脑组织中检测到的较弱阳性信号，主要存在于血管内皮细胞浆中，这是由于后期出现菌血症时，血液中的O46向组织内侵袭时需通过血管内皮细胞而分散在血管内细胞胞浆中的缘故。

表4 口服组各个时间点各组织IIS检测结果Table 4 IIS result of tissues for detection ofE.coliat different time after orally injection infected

图1 部分脏器IIS检测结果Fig.1 The partial results of organs IIS detection

图2 不同途径接种O46分离株的阳性信号检出时间分布情况Fig.2 Distribution of time for O46isolate positive signal detection with different inoculation approach

目前认为禽致病性大肠杆菌(APEC）主要通过呼吸道感染，APEC进入家禽的上呼吸道，首先附着气管上皮细胞，结合后的APEC不易被机体清除，很易侵入呼吸道深部进行定殖，这是细菌发挥其致病作用的关键一步。当侵入肺部时，APEC从肺泡毛细血管进入血液循环，引起菌血症，从而在全身组织内增殖，当家禽体内血液和组织抵抗力被抑制时，APEC大量繁殖，引起败血症。石火英等对APEC O18分离株研究结果表明，气管、肺和气囊是鸡E.coli定居的场所[8]。但在本实验中，人工感染O46分离株的雏鸭气管中均未检测到目的细菌阳性信号，不同途径接种E.coli均以心脏、肺脏及脾脏的阳性检出率最高。而口服组最早12 h可以在小肠、心、肺、肝和脾脏检测到阳性信号，表明O46分离株有别于其他血清型APEC的呼吸道感染，可能是通过肠道或其它途径感染家禽，感染机制有待进一步研究。

[1]Tivendale K A,Logue C M,Kariyawasam S,et al.Avian pathogenicEscherichia colistrains are similar to neonatal meningitisE.colistrains and are able to cause meningitis in the rat model of human disease[J].Infect Immun,2010,78(8）:3412-3419.

[2]于学辉，程安春，王远微，等.规模化养鸭场鸭源大肠杆菌分离株的致病性及系统发育分析[J].中国预防兽医学报，2011，33(12）:927-931.

[3]Wang Ying,Tang Cheng,Yu Xue-hui,et al.Distribution of serotypes and virulence-associated genes in pathogenicEscherichia coliisolated from ducks[J].Avian Pathol,2010,39(4）:297-302.

[4]Zhang Huan-rong,Pi J K,Tang C,et al.An experimental study of the pathogenicity of a duck hepatitis A virus genotype C isolate in specific pathogen free ducklings[J].Avian Pathol,2012,41(6）:613-620.

[5]Zainal Abidin I,Zulkarnaen A N,Norlida A O,et al.Hodgkin lymphoma mimicking a large soft tissue sarcoma of the shoulder:the essential role of immunohistochemistry in histopathological diagnosis[J].Malays J Med Sci,2012,19(4）:72-76.

[6]Gupta N,Krasnodembskaya A,Kapetanaki M,et al.Mesenchymal stem cells enchance survival and bacterial clearance in murineEscherichia coli pneumonia[J].Thorax,2012,67:533-539.

[7]Negroni A,Costanzo M,Vitali R,et al.Characterization of adherent-invasiveEscherichia coliisolated from pediatric patients with inflammatoty bowel disease[J].Inflamm Bowel Dis,2012,18(5）:913-924.

[8]石火英，高崧，王宝安，等.实验性鸡大肠杆菌病试验鸡细菌的动态分布[J].中国预防兽医学报，2001，23(5）：364-367.

The dynamic detection of duckE.coliO46distribution in organs of experimentally infected duckling by immunohistochemistry

RAN Dan-dan,YU Xue-hui,LUO Wei,LIU Fei,SUN Ji,LIU Ya-gang*
(College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu 610041,China）

To investigate the dynamic distribution of a pathogenic duckE.coliO46strain in different organs of ducklings after experimental infection,the ducklings were inoculated with theE.coliO46isolate via oral,intramuscular injection and subcutaneous routes,respectively.At different time points after infection,tissue samples were collected from 12 organs,and slices were prepared and tested by immunohistochemical assay with O46-specific antiserum to observe the bacterial antigen localizations in infected ducklings.The results showed that the bacterial antigen was detected in all organs except for trachea.Heart,lung,spleen kidney and intestinal tract were proven to be the main target tissues of the bacteria,and bacterial antigen mainly located in cytoplasm of infected cells.Positive signals were first detected in heart.The results obtained in this study suggested that theE.coliO46strain isolated from duck has a broad tissue tropism,and therefore could lead to acute onset and death of the ducks.

E.coliO46isolated;immunohistochemistry;infected duckling;dynamic change

S852.61

A

1008-0589(2014）03-0192-05

10.3969/j.issn.1008-0589.2014.03.06

*Correspondingauthor

2013-07-31

国家科技部农业成果转化项目(2013GDZF000422）；西南民族大学研究生创新型科研项目(CX2013SZ72）；中央高校基本科研业务费科研平台建设项目(11NPT03）

冉丹丹(1988-），女，土家族，贵州铜仁人，硕士研究生，主要从事动物传染病防治研究工作.

*通信作者：E-mail：LYG_068@163.com

(本文编辑：任安琦）