猫杯状病毒基因及其抗原多样性研究进展

赵艳丽，董宏伟,2，陈小庆，姜 雪，刘秋艳，胡桂学*

(1.吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130118；2.吉林省农业广播电视学校，吉林 长春 130021)

猫杯状病毒(Feline calicivirus，FCV)是杯状病毒科(Calicivirdae)水疮性病毒属(Vesivirus)的成员之一[1]，其基因组为单股正链RNA，无囊膜，核衣壳呈二十面体对称。FCV 可引起猫多发性口腔和呼吸道传染病，还可引起结膜炎，因此又称为猫传染性鼻-结膜炎病毒。自1957 年Fastier 首次分离鉴定FCV 以来，在欧洲、美洲、亚洲均有FCV 的报道，目前已呈世界性分布。几乎所有的猫科动物，如猫、虎[2]、狮[3]和猎豹[4]等对FCV 均易感，一岁以下的猫最易感，也有狗感染的报道[5]。FCV 感染猫通常局限于口腔和上呼吸道。有些病毒株可以引起慢性胃肠炎和急性关节炎[6]。FCV 感染与慢性口腔炎有密切的关系，多数感染的猫可以向外界排毒[7]。FCV 在猫群中高度流行，主要是因为许多的临床康复猫仍然是持续的病毒携带者。该病发病率较高，死亡率较低。近年来FCV 强毒变异株感染不断暴发，甚至发生在疫苗免疫猫中[8]，不仅会引起口腔、皮肤溃疡，还会导致肝、脾和胰脏的损伤，猫死亡率增加。FCV 变异株还可以引起猫的严重急性致命的全身性疾病(Virulent systemic disease，VSD)。

由于商品疫苗的使用，野毒株与活疫苗株F9 间的交叉保护反应逐渐变弱，疫苗免疫失败现象时有发生。现有的疫苗虽然能够减少临床症状和病毒的排出，但可能无法防止感染。强毒株引起的暴发和疫苗免疫失败与FCV 的基因及其抗原多样性密切相关。

1 病毒基因多样性

1.1 病毒基因组结构 FCV 通常被认为只有一个基因组[9]，不过日本学者研究证明两个分离基因组的存在[10]。在病毒感染的细胞中，除基因组RNA 外还存在着亚基因组RNA，基因组RNA 为7 600 nt，亚基因组RNA 为2 400 nt，二者5'端均连接着15 ku 的VPg 蛋白，VPg 蛋白取代了5'端的帽状结构，直接与蛋白翻译起始因子作用，启动病毒的翻译过程[11]。二者3' 端均连接着poly(A)，正链RNA病毒poly(A)尾巴与病毒复制及侵染性有密切联系[12]。病毒基因组RNA 包含3 个开放阅读框(ORF)，分别为ORF1、ORF2、ORF3。ORF1 编码非结构蛋白，包括一个病毒蛋白酶和RNA 依赖的RNA 多聚酶。ORF2 编码结构蛋白VP1，共有A-F 6 个区。A 区有一段FCV 共有序列，高度保守，A 区在衣壳蛋白VP1 成熟过程中被裂解掉；B区含有潜在的肉豆蔻化甘氨酸和ATP/GTP 结合位点，组成病毒的核心结构；C 区为可变区；D 区为高度保守区；E 区含有FCV 的抗原表位，含有主要B 细胞表位，可作为毒株分型的参照；E 区被28 个保守碱基(ConE)分成5'端和3' 端高变区(HRV)[13]，有人认为FCV 不同毒株之间发生交叉反应以及FCV 只具有单一血清型均与ConE 有关；F 区在衣壳蛋白的羧基端，高度保守，位于病毒的表面，是非中和单克隆抗体(MAbs)的连接位点。FCV 成熟的衣壳蛋白也能够自我组装成空衣壳即病毒样粒子(VLPs)，但不具有感染性[14]。ORF3 位于基因组的3' 末端，编码大小约为12 ku 的结构蛋白VP2。病毒亚基因组包含ORF2 和ORF3，病毒可能利用亚基因组RNA 进行基因表达。

1.2 病毒基因组多样性 FCV 属于RNA 病毒，与DNA复制基因信息相对精确相比，RNA 通常是不精确的，基因组具有高度适应性，在选择压力的作用下表现为进化快速。像许多其他的RNA 病毒一样，FCV 有能力发展核心的生存策略，主要体现在基因组的多样性上[15]。

FCV 病毒株间的基因变异型已被用于疾病暴发的流行病学调查。一些研究显示FCV 不同病毒株在衣壳变异区存在20 %～40 %的差异，而共享现在流行病学链的分离株，在该区的变异一般在6 %以下，很可能代表相同株的变异[16]。

澳大利亚FCV 分离株的衣壳蛋白与经典病毒株F9 的不同，其预测氨基酸序列的变化为整个衣壳蛋白的11 %～17.5 %，最明显的差异出现在HRV C 和E，HRV E 的变异为22 %～34 %。澳大利亚株对F9 株MAbs 缺乏反应性，这与其E 区结合位点的氨基酸改变有关[17]。vsFCV 株(FCV-33585)衣壳蛋白的HRV 基因序列与114 个已知序列比较分析显示vsFCV 株潜在的唯一特征是2 个氨基酸的变化[18]。首次分离于中国广东的FCV CH-GD 株的全基因序列与各参考株的同源性仅为75.4 %～77.1 %，明显低于各参考株之间的同源性78.9 %～99.9 %，而且CH-GD株有3 个区域的3 个连续的氨基酸发生了变异，3 个区域的抗原性和亲水性也发生了相应的变化[19]。分离自巴西南部南里奥格兰德的13 个FCV 株与F9 株比较，其ORF2(B-F)预测氨基酸序列的主要变异出现在C 区和HRV E，D 区、HRV E 5' 端、Con E 的抗原表位也出现一些变化，核苷酸距离值存在0.8 %～50.1 %的差异。这是首次对FCV 巴西分离株的序列分析及对其系统发育间关系的描述[20]。Radford 等确定了FCV 在细胞培养物和持续感染猫中的序列进化，并将其与病毒中和变化联系起来[13]。随后他们又鉴定了一个FCV 分离株衣壳基因HRV E 有一些轻微的变异，该病毒株与一个FCV 减毒活疫苗株密切相关，表明本地病毒已经从疫苗病毒中进化，而且持续存在[16]。Weeks 等对一株从佛罗里达州临床健康的家猫口腔中分离的FCV 序列分析显示其C、E、F 区序列与疫苗株F9 有显著差异，其HRV E 比疫苗株F9 少3 个氨基酸，显示当前流行的FCV 株可能与疫苗株不一致[21]。此外，Schorr-Evans 等研究表明致命的FCV、流行的FCV 以及疫苗株FCV-F9 在遗传和血清学上存在差异[8]。

由于抗FCV 疫苗的免疫失败，在日本开展了有关能够引起疫苗免疫失败的野毒株(Vaccine breakdown strains，VBS)基因及特性的相关研究。2007 年Ohe 等从接种商业FCV 疫 苗(F9、FCV-255、FC-7)的猫中分离出15 个FCV-VBS 株并检测其基因组。进化树分析显示8 个分离株(53 %)、疫苗株F9、FCV-255 属于基因群I(G(A)I)，7个分离株(47 %)属于基因群II(G(A)II)，从接种F9、FCV-255、FC-7 疫苗的猫中分别分离到的VBS 株依次为属于G(A)II 的多于G(A)I、G(A)II 少于G(A)I、G(A)II 等于G(A)I，表明病毒分离株的基因群随着疫苗株的使用而变化；猫抗F9 和兔抗FCV-255 血清对15 个分离株的中和滴度都非常低，表明中和抗体滴度和基因群没有关系；病毒分离株和疫苗株的基因序列同源性低，为70.6 %～82.9 %，表明没有病毒株序列来自疫苗株；氨基酸序列比对显示从接种F9、FCV-255 疫苗的猫中分离的FCV-VBS株在F9 株衣壳蛋白区5' 端HRV 位置有些变化，推测这些变化可能影响基因群；从接种F9 疫苗的猫中分离到的FCV-VBS 株，G(A)I 和G(A)II 共有的F9 线性表位氨基酸的改变发生在分离株衣壳蛋白E 区5' HRV 450，451，457 位置，接种FCV-255 疫苗的发生在449，450，451 位置，这些氨基酸的改变参与逃逸，与疫苗免疫失败有关，这些结果显示交替使用F9 和FCV-255 疫苗或包含G(A)II株的多价疫苗能够抑制病毒进化或变异[22]。随后他们研究认为疫苗免疫失败存在两个机制：一个是与疫苗免疫水平有关，另一个是无关。FCV-VBS 的特点为：病毒感染前带有抗体滴度高时，病毒持续排出的时间短；排出的病毒分子种类不断变化，并不是随着时间限制在一个特定的种类；病毒物理化学性质持续改变，FCV-VBS 改变了分子物种和物理化学特性，归因于宿主免疫压力减少，可能导致VSD[23]。

也有学者对FCV 持续感染和多样性的进化机制进行了探讨。Pedersen 等认为FCV 持续感染不能单一地通过VBS 株的出现来解释，疫苗病毒本身可能有助于急性、慢性感染和疾病的发生[24]。Coyne 等利用分布在5 个不同地理位置上的家猫FCV 的流行感染，通过测定其衣壳蛋白免疫主导区和可变区序列，确定了病毒利用的不同进化过程对确保它长期在宿主内生存的相对贡献。研究表明真正在个体中长期持续的感染是比较罕见的，大多数病毒携带者经历病毒逐渐演变和循环感染，在个体水平逐渐演变和在个体和群体水平变异株再感染与积极选择有关。逐渐演变和变异株再感染引导一个特定病毒株在个体和群体中的多样性逐渐增加，直到新病毒株出现[25]。他们的最新研究表明在大多数情况下，空间和时间不同的病毒株在系统发育过程中混合，当前的FCV 进化与病毒株间的选择竞争无关。相反，伴随许多病毒株的共同流行，这些变异可能通过从头演变和从更广泛的自然中偶尔的基因流动在群体水平上存在，这种复杂性首次提供了判断当地和国家水平疫苗交叉保护的一个基准[26]。

2 病毒抗原多样性

由于FCV 基因组不同，FCV 抗原也呈现出多样性，FCV 包含大量的病毒株，在病毒株之间有大量的抗原变异，大多数的病毒株被分为不同的抗原。这些抗原的不同已经被用于开发FCV 的分型方法[17]。可以认为所有的FCV 株都属于一个抗原多样的血清型。

McArdle 等利用6 个抗FCV-F9 株的MAbs 检测了55个FCV 分离株，结果显示F9 株与6 个MAbs 均反应，而一些野毒株与任何一个都不反应。有口腔/呼吸症状组的分离株很少与MAbs 反应，表明这些毒株与F9 株相关性低，同时显示即使与F9 株密切相关的病毒株，也不能与6 个MAbs 都发生反应[27]。Lauritzen 等通过血清稀释的中和试验确定了来自美国和英国的181 个FCV 分离株与5个参考株的抗原关系，参考株包含2 个疫苗株(F9，2280)和3 个野毒株(H，J，TN)。只有少量的英国株能够被所有参考株的特定血清中和，没有任何一个参考株在美国所有地理位置都占据主导，2280、H、J 株的抗血清能中和最高数量的分离株，F9 株与来自1958 年～1979 年间的分离株抗原相似性达到86 %，与来自1980 年～1995 年间的分离株抗原相似性降至43 %，J 株维持它的抗原相关性，与最近40 年的分离株代表的相似性达到75 %[28]。Rinaldo等通过体外中和试验，评估了F9 株与从意大利具有FCV感染临床症状猫中分离的野毒株的抗原相关性，确定了F9 株和猫群中蔓延的FCV 株相关性低[29]。Addie 等通过8个感染F9、255、FCVG1 和FCV431 的猫产生的抗血清检测了来自英国的110 个FCV 野毒株的交叉中和易感性，研究显示抗新疫苗株FCVG1 或FCV431 抗血清比抗F9 和255 抗血清能中和更大比例的野毒株[30]。

FCV 抗原的多样性是当前疫苗免疫失败的主要原因，衣壳蛋白基因可变区免疫主导位点的抗原多样性解释了逃逸突变体的出现[31]。一些研究认为FCV 抗原的变异来自疫苗引起的免疫压力[13,28]。抗原的多样性意味着没有疫苗能中和所有的病毒分离株，这对于筛选制备疫苗的抗原带来困难。

3 结语

FCV 基因多样性导致不同病毒株对宿主组织嗜性的不同，从而引起了致病性的改变，FCV 除了能引起典型的呼吸、慢性胃肠炎和急性关节炎等疾病以外，还能引起VSD 和流行性出血热样疾病，呈现出不同的临床症状。在美国，FCV 致命的突变已经作为VSD 的一个病因，该病的特点是疫苗免疫的成年猫暴发性黄疸，水肿，高死亡率[8,32]。2003 年英国暴发相似的疾病[33]。2009 年法国暴发了VSD，其症状、病程、临床结果和病变是典型的FCV引起的VSD[34]，但各地引发VSD 的FCV 株各不相同。2013 年意大利出现了第一例疑似FCV-VSD，临床、尸检和实验室研究表明与之前报道的FCV-VSD 类似。发病猫同时感染了猫免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus，FIV)，而其他的猫尽管直接接触病猫也没有感染，表明FIV 感染可能有利于致病性FCV 株的增殖[35]。2000 年一个新的高致病性FCV 株引起猫流行性出血热样疾病[32]。2003 年一个小动物医院暴发了24 例不寻常的致命FCV 感染，环境和症状与在北部加利福尼亚暴发的FCV 出血性疾病相似[8]。

综上所述由FCV 引起的疾病变得难于控制，迫切地需要研制新型有效的疫苗。我们实验室正在致力于FCV 的反向遗传研究，希望能从DNA 水平上对FCV 基因组进行体外操作，研制出能抵御FCV 感染发病的新型疫苗。

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