叶酸与氨基酸相互作用的荧光光谱
2014-03-07齐春玲付彩霞
齐春玲,付彩霞
(1.济南市第七中学化学组,山东济南 250013; 2.滨州医学院化学教研室,山东烟台 264003)
叶酸与氨基酸相互作用的荧光光谱
齐春玲1,付彩霞2*
(1.济南市第七中学化学组,山东济南 250013; 2.滨州医学院化学教研室,山东烟台 264003)
在模拟动物生理条件下,利用荧光光谱法在分子水平上研究了叶酸同色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的相互作用;根据双对数方程求出了不同温度下两者反应的结合常数和结合位点数.结果表明:叶酸能导致氨基酸的荧光猝灭,三种氨基酸的猝灭机制均为静态猝灭;从相应的热力学参数可知,色氨酸和酪氨酸与叶酸之间的主要作用力为疏水作用力,而苯丙氨酸与叶酸之间的主要作用力为氢键和范德华力.
叶酸;氨基酸;相互作用;荧光光谱
氨基酸是构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质,如果人体缺乏任何一种必需氨基酸就可导致生理功能异常,影响抗体代谢的正常进行,最后导致疾病.酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸是三种含苯环的芳香族氨基酸,是蛋白质内源荧光的来源,蛋白质内源荧光的变化也依赖于这些荧光基团性质的改变,因此研究芳香族氨基酸的物理化学性质、反应特性和生物活性具有重要意义.
叶酸(FA)是一种水溶性维生素,因为最初是从菠菜叶子中分离提取出来的,故得名“叶酸”.叶酸与DNA的合成密切相关,叶酸缺乏时,细胞内DNA合成减少,细胞的分裂成熟发生障碍,引起巨幼红细胞性贫血[1].小肠疾病能干扰食物叶酸的吸收和经肝肠循环的再循环过程,故叶酸缺乏是小肠疾病常见的一种并发症 .有关叶酸与BSA及金属离子的相互作用已有报道 ,但叶酸与氨基酸相互作用的研究未见报道,因此本文作者采用荧光光谱法,在生理条件下研究了叶酸与色氨酸(tryptophan,Try)、酪氨酸(Tyrosine,Tyr)及苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)的相互作用,获得了一些有价值的信息.
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
LS-55型荧光分光光度计(美国Perkin EImer公司);pH-3C酸度计(上海逸龙科技有限公司);AR1140型电子分析天平(OhausCorp.PineBrook,NJ,USA);电热恒温水浴锅(龙口市先科仪器公司);KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).
叶酸(国药集团化学试剂有限公司);色氨酸(天津市大茂化学试剂厂);酪氨酸(天津市博迪化工有限公司);苯丙氨酸(天津市大茂化学试剂厂).
叶酸用0.5%氨水溶液溶解,用二次蒸馏水配制成浓度为1.00×10-4mol·L-1的溶液;用0.1mol· L-1,pH=7.40的Tris-HC1(内含0.10mol·L-1的NaCl溶液以维持离子强度)缓冲溶液分别配制浓度为1.00×10-4mol·L-1的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸溶液;实验用水均为二次蒸馏水,经检测均无荧光杂质,其他试剂均为分析纯.以上溶剂均放入冰箱,在4℃避光保存.
1.2 实验方法
分别取3mL三种氨基酸溶液加入石英比色皿中,依次加入10μL叶酸溶液(加入体积<100μL,忽略体积对浓度的影响),摇匀,静置5min,分别在21,37℃下扫描荧光光谱,Try、Tyr和Phe的激发波长分别为276、272和261nm,在280~550nm范围内记录荧光光谱.
2 结果与讨论
2.1 FA与氨基酸的相互作用
色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸能产生荧光.当激发波长为276nm、272nm和261nm时,色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的荧光峰位分别于358nm、306nm和291nm附近.由图1可见,FA在氨基酸荧光发射峰附近无荧光发射峰,随着FA浓度的增加,氨基酸的峰位置及峰形基本保持不变,但氨基酸的荧光强度有规律地降低,说明FA对氨基酸的荧光有猝灭现象,FA与氨基酸之间存在相互作用.此外,同一条件下苯丙氨酸荧光强度明显低于酪氨酸和色氨酸,这与白蛋白具有的荧光强度主要来自于色氨酸残基和酪氨酸残基[5]相一致.
图1 21℃下叶酸对氨基酸的荧光猝灭光谱Fig.1 The fluorescence quenching spectra of BSA in the presence of aminoacid at 21℃
2.2 FA与氨基酸作用的荧光猝灭方式
引起氨基酸荧光猝灭的原因可能有动态猝灭和静态猝灭,前者是一种能量转移或电子转移过程,不影响氨基酸的结构和生理活性,遵循Stern-Volmer方程;后者则是由于发生了配合作用,通常是产生了不发荧光的配合物,可影响其生理活性.荧光猝灭符合下列关系式:
式中F0为未加入FA时的氨基酸荧光强度,F为FA浓度等于cFA时的荧光强度,KSV为猝灭常数,Kq为动态猝灭常数,τ0为猝灭剂不存在时荧光物质的平均寿命(Try、Tyr和Phe的荧光寿命分别为3.1×10-9,3.6× 10 和6.8×10s ).各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散速率常数为2.0×10L·mol·s ,如果所求得的Kq值远大于2.0×1010L·mol-1·s-1,则此猝灭过程为静态猝灭过程;反之,则为动态猝灭.由式(1)作出21,37℃下,叶酸对氨基酸荧光猝灭的Stem-Volmer曲线(见图2).
图2 FA和氨基酸相互作用的Stern-Volmer曲线Fig.2 Stern-Volmer plots of the interaction between FA and aminoacid
由直线的斜率可求出21和37℃下,KSV、Kq和线性回归系数R值(见表1).由表1得出叶酸与三种氨基酸的线性拟合程度很高,Kq值均在1013L·mol-1·s-1数量级以上,远远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭速率常数2×1010L·mol-1·s-1,表明叶酸对氨基酸的猝灭过程不是由扩散和碰撞引起的动态猝灭,而是形成复合物的静态猝灭过程[8].从表1还可以看出,温度对KSV的影响不大,说明温度对氨基酸与叶酸结合的影响较小.
表1 FA与氨基酸相互作用的Stern-Volmer常数和相关系数Table 1 Stern-Volmer constants and correlation cocefficients of FA with aminoacids
2.3 FA与氨基酸的结合常数和结合位点数
根据关系式(2),分别在21、37℃下作lg[(F0-F)/F]对lgc的双对数图,由截距和斜率求得不同温度的结合常数KA和结合位点数n(见表2).
式中KA为叶酸与氨基酸的结合常数,n为叶酸与氨基酸结合位点数.
表2 FA与氨基酸相互作用的相关参数Table 2 Related parameters for FA binding with aminoacids
由表2可以看出,由于氨基酸与FA的结合常数具有较大的数值,故氨基酸和FA间存在较强的相互作用,结合位点数n都近似等于1.
2.4 FA和氨基酸的主要作用力类型
药物小分子和生物大分子之间的作用力主要有氢键、静电作用、范德华力、疏水力[9-10].根据热力学公式:
由不同温度下的结合常数,求得ΔH、ΔS、ΔG,列于表1中.根据反应前后热力学焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小,可以判断FA与氨基酸之间的主要作用力类型[11]:ΔH>0、ΔS>0主要为疏水作用力;ΔH<0、ΔS<0主要为氢键和范德华力;ΔH<0、ΔS>0主要为静电引力.从表1可以看出,FA与氨基酸的相互作用是自发的(ΔG<0).由苯丙氨酸的ΔH<0及ΔS<0的事实推断,FA与Phe之间的作用力主要是氢键和范德华力;而由色氨酸和酪氨酸的ΔH>0、ΔS>0的事实推断,FA与Try、Tyr之间的作用力主要为疏水作用力.
3 结论
本实验用荧光光谱法证明了氨基酸与叶酸共存时能够发生相互作用.结果表明,FA对氨基酸产生了较强的荧光猝灭作用,并且色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸与FA作用的猝灭均属于静态猝灭.求得了氨基酸与FA的结合常数、结合位点数和热力学参数.热力学数据表明,FA与Phe之间的作用力主要是氢键和范德华力;而FA与Try,FA与Tyr之间的作用力主要为疏水作用力.这些研究结果将有助于了解FA在体内的运输和分布情况,对于阐明FA的药物作用机制具有一定的参考价值.
[1]杨玉柱,王储炎,焦必宁.叶酸的研究进展[J].农产品加工(学刊),2006(5):31-35.
[2]陈青川,牟世芬.叶酸与人体健康[J].化学教育,1996(8):1-5.
[3]付彩霞,高宗华,王海英.光谱法研究叶酸与牛血清白蛋白在含铁(Ⅲ)环境中的相互作用[J].化学研究,2013,24(1):71-74.
[4]付彩霞,荣先国,李凤.荧光光谱法研究叶酸与牛血清白蛋白的相互作用[J].光谱实验室,2013,30(4):1610-1613.
[5]周享春,颜昌琪,颜承农.溴百里酚蓝与牛血清白蛋白的相互作用研究[J].化学研究与应用,2010,22(1):18-23.
[6]许倩影,刘忠芳,胡小莉,等.Pd(Ⅱ)与色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸相互作用的荧光光谱[J].高等学校化学学报,2011,32(7):1492-1496.
[7]杨曼曼,杨频,张立伟.荧光法研究咖啡酸类药物与白蛋白的作用[J].科学通报,1994,39(1):31-35.
[8]俞思明,彭运平,于淑娟,等.胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析[J].光谱学与光谱分析,2012,32(8):2166-2170.
[9]BRAUN A M,MAURETTE M T.Photochemical Technology[M].New York:Oliveros E Wiley,1991:41.
[10]LIU B S,XUE C L,WANG J.Study of the conjugation reaction between bovine serum albumin and gentamicin with Ponceau S as fluorescence probe[J].Monatsh Chem,2012,143:203-209.
[11]ROSS D P,SUBRAMANIAN S.Thermodynamics of protein association reactions:forces contributing to stability[J].Biochemistry,1981,20(11):3096-3099.
Interaction of folie acid and amino acids by fluorescence spectrometry
QI Chunling1,FU Caixia2*
(1.ChemistryGroup,JinanSeventhMiddleSchool,Jinan250013,Shandong,China;2.ChemistryStaffRoom,BinzhouMedicalCollege,Yantai264003,Shandong,China)
The interactions between folie acid and amino acids including thetryptophan,tyrosine,phenylalanine were investigated by fluorescence spectroscopy under simulated physiological condition of animal body;and the binding constants and the number of binding sites were calculated with double logarithmic equation.Results show that folie acid is able to quench the fluorescence intensity of the amino acids;and the quenching of the three amino acids by folie acid is a static quenching process.Relevant thermodynamic parameters demonstrate that hydrophobic force plays a major role in the binding of folie acid with tryptophan and tyrosine,while both hydrogen bond and Van der Waals force play a major role in the binding of folie acid with phenylalanine.
folie acid;amino acid;interaction;fluorescence spectrometry
O 655
A
1008-1011(2014)02-0148-04
2013-12-06.
山东省教育厅科技计划资助项目(J08LG15).
齐春玲(1965-),女,中学高级教师,主要从事中学化学教学和光化学分析研究.*
,E-mail:fcx6309@163.com.