Dot-ELISA和RT-PCR检测南方水稻黑条矮缩病毒灵敏度的比较

刘珊珊，周 倩，2，高必达，2，李有志，2，张政斌，郭海明

（1. 湖南农业大学植物保护学院，湖南 长沙 410128；2. 植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128；3. 湖南省植保植检站，湖南 长沙 410005）

南方水稻黑条矮缩病毒（Sou thern rice b lackstreaked dwarf virus，SRBSDV）引起的水稻病害由华南农业大学周国辉教授于2001在广东省首次发现，2008年被鉴定为斐济病毒属中一暂定新种[1]。该病毒主要通过白背飞虱传播，危害水稻，玉米、小麦等禾本科作物和一些田间杂草。最近几年由SRBSDV引起的水稻矮缩病在我国南方和越南发生严重。2009年湖南、江西等九省受害面积达到数千公顷，2010年，发病范围扩大至西南及长江中下游部分单季稻区，江淮局部地区也检测到感病植株，且感病程度逐年加重，由零星田块分布转为连片分布，个别田块甚至绝收[2]。2011、2012年全国南方黑条矮缩病发生程度比前几年低，但发生地区更集中[3]。南方水稻黑条矮缩病一旦发生，目前没有有效的治疗药剂，因此病害的预测预报对病害防治至关重要。检测白背飞虱、田间杂草和水稻植株的带毒率是病害预测预报的基础。

目前检测病毒常用的方法大致分为分子检测技术和血清学检测技术两类。分子检测技术是一种基于核酸水平的检测，具有准确高效、灵敏快速的特点，但操作比较复杂，成本高。血清学检测技术是以抗原抗体特异性反应为基础的检测技术，具有快速灵敏经济的特点，并且操作简单，但如果抗体非特异性结合容易造成假阳性[4-7]。为了寻找一种适合SRBSDV大量样本检测的方法，比较了RT-PCR和Dot-ELISA两种检测方法的灵敏度，以期为基层植保人员检测SRBSDV提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 2012年湖南省郴州北湖区经检测感染SRBSDV的水稻植株。

1.1.2 介体材料 室内人工饲毒的白背飞虱群体，经过RT-PCR方法检测获得带毒虫汁液及RNA。

1.1.3 试 剂 南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）Dot-ELISA试剂盒（农业部农技技推广中心），Trizol（TaKaRa），5×first stand buffer ，M-M LV反转录酶（均购自Invitrogen），Taq DNA聚合酶，dNTP，10×PCRbu ffer，DNase/RNase-Free去离子水（天根生化科技有限公司），GoldenVieⅡ（Solarbio）随机引物（上海生物工程技术服务有限公司），Trans2K DNA Marker，Trans2K Plus II DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司），特异性引物：S10F为5'-TTAAGTTTATTCGCAACTTCGAAG-3'，S10R为5'-GTGATTTGTCAGCATCTAAAGCG-3'[8]。

1.2 方 法

1.2.1 样品处理 植物材料：取1 g患病水稻茎秆于液氮中反复研磨至粉末状，部分粉末转移至2支离心管，分别称重，再进行RT-PCR和Dot-ELISA检测。

介体材料：取单头白背飞虱于离心管中，加20 μL的PBS研磨， 5 000 g离心3 m in后，分别取10 μL研磨液于新离心管，分别进行RT-PCR和dot-ELISA检测。

1.2.2 RT-PCR检测 （1）总RNA提取。向上述样品处理物中加入1 m L Trizol，涡旋器上振荡混匀。然后加入500 μL的氯仿/异戊醇（24∶1），混匀，冰浴静置10 m in。4℃ 12 000 g 离心15 m in，取上层水相，转移至另一新离心管。加入等体积异丙醇，混匀， 冰浴放置30 m in，4℃ 12 000 g 离心10 m in，弃上清，加入1 m L 70%乙醇，悬浮沉淀，4℃ 7 500 g 离心5 m in，尽量弃上清。加入1 m L无水乙醇，悬浮沉淀，4℃ 7 500 g 离心5 m in，尽量弃上清。室温或真空干燥1 m in，加入30 μL DNase/RNase-Free去离子水，－20℃保存备用（白背飞虱研磨液加200 μL Trizol和100 μL的氯仿/异戊醇抽提，其余步骤相同，沉淀最后溶于10 μL DNase/RNase-Free去离子水）。

（2）植物材料RNA稀释。取1 μL总RNA用DNase/RNase-Free去离子水进行5倍、10倍、20倍、100倍、1 000倍、5 000倍稀释。

（3）白背飞虱RNA稀释。取1 μL总RNA用DNase/RNase-Free去离子水进行5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1 000倍、5 000倍稀释。

（4）反转录。反应总体积20 μL，分别加入DNase/RNase-Free去离子水9 μL，随机引物1 μL，上述经稀释的RNA样品3 μL，65℃水浴5 m in，立即冰上孵育5 m in， 继续加入5×first stand buffer 4 μL， dNTP（10 mmol/L）2 μL，M-MLV反转录酶（200 U/μL）1 μL，在42℃水浴1 h，得到cDNA。

（5）PCR扩增：反应总体积25 μL，DNase/RNase-Free去离子水17.5 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/L） 0.5 μL，S10F（10 μ mol/L） 1 μL ， S10R（10 μ m ol/L） 1 μL，TaqDNA聚合酶（2.0 U）0.5 μL，cDNA 2 μL。扩增程序为首先95℃预变性5 m in，然后95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸45 s，35个循环，最后72℃延伸10 m in。反应结束后，取8 μL反应产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，Golden View Ⅱ染色，在凝胶成像系统中观察照相。

1.2.3 Dot-ELISA检测 （1）样品的制备与稀释。取上述植物材料样品处理物，加入5.2 m L的PBS（PBS按试剂盒说明书 样品∶PBS = 1 g∶20 m L 加入），装入离心管，5 000 g， 离心3 m in。取上清液做为原液，用PBS进行5×、10×、20×、100×、1 000×、5 000×稀释；取白背飞虱样品处理物用PBS进行5×、10×、20×、50×、100×、500×、1 000×、5 000×稀释。

（2）点样。用镊子取一张NC膜放置干净的培养皿内，分别取2 μL原液及稀释后的液体轻点到NC膜上，每个样品更换枪头。

（3）干燥。样品点膜完成后在室温下干燥10～20 m in。

（4）封闭。先往干净的空培养皿中加入1 g脱脂奶粉，然后加入2 m L 10×浓缩封闭液和18 m L去离子水，用枪头抽吸混匀，再把NC膜放入稀释好的封闭液中，摇床上室温封闭30 m in。

（5）一抗孵育。依次往干净的空培养皿中加入1 g脱脂奶粉，2 m L 10×浓缩抗体稀释液和18 m L去离子水，枪头抽吸混匀后加入10 μL SRBSDV单克隆抗体，再晃动混匀，放入NC膜，摇床上室温孵育30～60 m in。

（6）洗涤。用去离子水将20×浓缩洗涤液稀释成1×洗涤液（即1 m L20×浓缩洗涤液+19 m L去离子水），取20～30 m L洗涤液至空培养皿中，放入NC膜，轻轻晃动洗涤，每次3 m in，共4次。

（7）二抗孵育。依次往干净的空培养皿中加入1 g脱脂奶粉，2 m L 10×浓缩抗体稀释液和18 m L去离子水，枪头抽吸混匀，然后加入3 μL AP标记羊抗鼠IgG二抗（白背飞虱样品处理物加入10 μL HRP标记羊抗鼠IgG二抗），再晃动混匀，放入NC膜，摇床上室温孵育30~60 m in。

（8）洗涤。取20~30 m L洗涤液至空培养皿中，放入NC膜，轻轻晃动洗涤，每次3 m in，共5次；

（9）显色底物液配制。在一个干净的培养皿中依次加入10 m L底物缓冲液，66 μL NBT和33 μL BCIP，晃动混匀。

（10）显色及终止。将洗好的NC膜用滤纸吸干后放入上述显色底物液中避光显色，待阳性对照显色明显，而阴性对照没有任何显色时终止反应，即在自来水中漂洗一下，洗去底物，肉眼观察结果，并记录（白背飞虱样品处理物加入2 m L TMB显色液直接显色）。

2 结果与分析

2.1 带毒水稻的检测

RT-PCR检测方法最终可以检测到RNA的最大稀释倍数为原液的1 000×（结果见图1）。称取的植物材料样品处理物0.261 g，提取的总RNA，溶于DNase/RNase-Free去离子水，取1/10 的RNA做20 μL反应体系的RTPCR，再从中取1/10的RT产物做25 μL反应体系为的PCR，最后取8/25的反应液跑胶。检测到稀释1 000×的RNA，通过计算得出能被检测的最小感病组织重量为0.83 μg。

Dot-ELISA检测方法最终可以检测到的最大稀释倍数为原液的20×（结果见图2）。称取的植物材料样品为0.265 g，按试剂盒要求加入5.3 m L PBS，经梯度稀释，分别取2 μL 点样在NC膜上，经计算得出原液样品组织重量为100 μg。最终能被检测的最小感病组织重量为5.0 μg。

图1 RT-PCR技术检测带毒水稻Fig.1 Detection of diseased rice plants by RT-PCR

图2 Do t-ELISA技术检测带毒水稻Fig.2 Detection of diseased rice p lants by Dot-ELISA

2.2 带毒白背飞虱的检测

取单头白背飞虱于离心管中，加20 μL的PBS研磨，5 000 g 离心3 m in后，分别取10 μL研磨液于新离心管，进行RT-PCR和Dot-ELISA检测。采用RT-PCR技术检测方法最终可以检测到的最大稀释倍数为原液的100倍（结果见图3），Dot-ELISA检测方法结果能检测到原液（结果见图4）。

3 讨 论

分别用RT-PCR和Dot-ELISA检测感病水稻和带毒飞虱并比较了两种检测方法的灵敏度，两种方法所检测材料来自同一株水稻和同一头白背飞虱，结果具有可比性。试验结果表明，RT-PCR检测技术比Dot-ELISA检测技术更灵敏。Dot-ELISA技术检测结果容易受到温度、显色时间长短的影响，样品内的一些成分，如蛋白质、内源性酶、叶绿素等也会干扰检测结果，导致其灵敏性比RT-PCR技术低[9-11]。然而，Dot-ELISA检测技术在检测样品原液时，其检测结果和RT-PCR检测技术的检测结果具有一致性，由于其操作较RT-PCR技术简

图3 RT-PCR技术检测带毒白背飞虱Fig.3 Detection of diseased white-backed planthopper by RT-PCR

图4 Do t-ELISA技术检测白背飞虱Fig.4 Detection of diseased white-backed p lanthopper by Dot-ELISA

单，适用于大规模样品的检测。在做南方水稻黑条矮缩病的预测预报时往往需要大量检测白背飞虱带毒率，判断病害发展情况，Dot-ELISA技术可以通过扩大NC膜的面积来增大检测样品的数目，更简便、经济、快速。对于水稻植株的检测，由于SRBSDV与RBSDV的CP蛋白的氨基酸序列同源性很高，Dot-ELISA技术在检测感病水稻时无法区别南方水稻黑条矮缩病和水稻黑条矮缩病[12]，而RT-PCR技术基于高度特异性的引物可以区别二者[13]。因此，建议在检测感病植株时采用RT-PCR检测技术，检测白背飞虱则选择Dot-ELISA技术。

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