人多巴胺D2受体基因内含子区51103 T/C多态性对基因转录活性的影响

段朝霞，张洁元，陈魁君，李晓霞，王建民，李兵仓

多巴胺D2受体(DRD2)是多巴胺受体之一，属于G蛋白偶联家族，能通过与 Gi/Go偶联抑制cAMP的形成，在体内发挥重要作用。DRD2主要分布于纹状体内，参与认知、情绪、运动及内分泌等多种功能活动的调节［1］。人类DRD2基因位于第11号染色体，全长270 kb，共有8个外显子。大量研究证实，DRD2基因多态性与创伤后应激障碍(PTSD)、抑郁症、精神分裂症、药物及酒精成瘾等精神类疾病发生的易患性及药物治疗的敏感性相关［2-5］。本课题组前期的研究通过HapMap检索发现DRD2基因第3内含子区51 103 bp位点的rs2075652多态性可能与PTSD的易患性相关，然而截至目前该位点的具体生物学机制还不十分清楚。鉴于此，本研究拟构建含单核苷酸多态性(SNP)rs2075652位点的DRD2基因荧光素酶表达载体，为今后探索其生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 pmirGlo质粒、海肾荧光素酶表达质粒pRL-SV40、DNA纯化试剂盒和双荧光素酶报道基因试剂盒均为Promega公司产品;质粒提取试剂盒、基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物技术有限公司;高保真DNA聚合酶、胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶购于Takara公司(大连);限制性内切酶Sac I、Xho I购自NEB公司;脂质体Lipofectine 2000TM为Invitrogen公司产品;DMEM、胎牛血清购自Gibco;人胚肾癌细胞株HEK293购自中国科学院细胞库，为本研究组保存，培养于含有 10%FBS的DMEM培养基中;感受态细胞E.coli DH5α和培养基等其他试剂均由南方中心实验室提供;PCR引物由上海生物工程有限公司合成;PCR产物和质粒测序均由Takara公司(大连)完成。

1.2 实验方法

1.2.1 含rs2075652多态位点的第3内含子区序列扩增及纯化:按照北京天根生物技术有限公司试剂盒说明书提取人全血基因组DNA，经核酸定量仪定量后置于-70℃备用。根据DRD2基因组序列NC-000011.9 Reference GRCh37.p5 Primary Assembly(GenBank，上下游各延伸 10 kb的序列范围:113270317～113356001)，设计4条扩增DRD2第3内含子区序列及51 103 bp位点突变的引物。rs2075652-1:5＇ ctgcactggacactggggactctag 3＇，rs2075652-2:5＇cttggggatccttgccggttact 3＇;rs2075652-M1:5＇atcccaactaccatttgtaaagtgcttac 3＇;rs2075652-M2:5＇gtaagcactttacaaatggtagttgggat 3＇。以人全血基因组DNA为模板，先用rs2075652-1与rs2075652-2扩增启动子区序列，并克隆至PTA2载体中，测序鉴定正确后，再双酶切(Sac I+Xho I)，然后亚克隆至pmir-Glo载体。含突变位点的序列则以PTA2-652质粒为模板，以引物rs2075652-1和rs2075652-M1、引物rs2075652-2和rs2075652-M2分别进行聚合酶链反应(PCR)后，再以两段 PCR产物为模板，以rs2075652-1和rs2075652-2为引物，进行融合PCR反应。PCR反应均采用25μl反应体系进行PCR扩增，循环参数为:98℃ 5 min，98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，35 个循环，72℃ 10 min。取 5 μl PCR产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并用胶回收试剂盒回收目的条带。

1.2.2 荧光素酶报告基因质粒的构建及鉴定:胶回收的PCR产物与经过改造的报告基因载体pmirGlo均以Sac I和Xho I双酶切，对目的条带采用胶回收并进行纯化。纯化过的DNA片段和质粒按2︰1的比例，在 T4 DNA连接酶作用下连接2 h，得到重组质粒pmirGlo-DRD2-T和pmirGlo-DRD2-C。将重组质粒转化DH5α细菌，于含氨苄西林的LB培养基平皿上进行选择培养。挑取其中3个克隆扩增并经Sac I和Xho I双酶切和测序鉴定。测序工作由Takara公司(大连)完成。

1.2.3 细胞转染及荧光素酶转录活性测定:将处于对数生长期的HEK293细胞经胰酶消化后重悬，细胞密度为1.5×105个/ml，各取200 ml/孔接种于48孔板内，置于37℃、5%CO2孵育箱中培养。细胞汇合度为80%左右时，将重组质粒pmirGlo-DRD2-T和pmirGlo-DRD2-C转染细胞，为校正孔间转染效率，各组均用表达海肾荧光素酶报告基因质粒pRLSV40同时进行转染，每个样品设3个重复孔。转染采用脂质体法:首先形成Lipofectine-DNA复合物，室温静置20 min后，将Lipofectine-DNA复合物加入细胞培养液中，培养6 h后更换成含10%血清的培养基继续培养48 h后收集细胞，检测荧光强度，实验结果取各次平均值。

1.2.4 双荧光素酶报告基因监测系统检测荧光素酶活性:取细胞裂解液20μl，在其中加入100μl的Firefly luciferase检测试剂，混匀后立即在化学发光仪中检测发光值，记录10 s时的值(对应于Firefly的表达水平);然后再加入100μl的stop＆Glo试剂，同样检测10 s时的化学发光值(对应于Renilla荧光素酶的表达水平)，以二者比值(F/R)为校正后的结果，实验重复3次。

1.3 统计学方法 应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，所有数据以均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析，α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 含rs2075652多态位点的第3内含子区序列PCR扩增 将PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下可见1条明显的DNA条带位于399 bp附近，与所需扩增片段大小相符，且无非特异性扩增片段，此条带即为设计扩增含rs2075652位点T的目的片段(见图1A)。将目的片段克隆至PTA2载体中，进行测序鉴定。再以PTA2-652质粒为模板，以引物rs2075652-1和rs2075652-M1、引物rs2075652-2和rs2075652-M2分别进行PCR扩增，分别扩出278 bp和189 bp的目的条带(见图1B);再以两段 PCR产物为模板，以 rs2075652-1和rs2075652-2为引物，进行融合 PCR反应，扩增出399 bp的含rs2075652突变位点C的目的条带(见图1C)。

图1 含rs2075652-多态位点的第3内含子区序列PCR扩增产物A.用rs2075652-1和rs2075652-2引物、人基因组DNA为模板扩增的PCR产物;M.DL2000 DNA Marker，1.扩增的PCR产物。B.用rs2075652-1、rs2075652-M1和 rs2075652-M2、rs2075652-2两对引物分别扩增的 PCR产物;M.DL2000 DNA Marker，1.rs2075652-1、rs2075652-M1扩增的PCR产物，2.rs2075652-M2、rs2075652-2扩增的PCR产物。C.用rs2075652-1和rs2075652-2为引物、B的两种PCR产物为模板扩增的融合PCR产物;M.DL2000 DNA Marker;1.融合扩增的PCR产物

2.2 重组质粒的酶切鉴定 重组质粒转染大肠杆菌克隆、培养，随机挑取3个单菌落中的少许菌体为模板进行扩增并经Sac I和Xho I双酶切鉴定结果见图2，得到大小为7 kb左右的pmirGlo质粒片段和含rs2075652 T和rs2075652 C的第3内含子区的目的条带。1号克隆送公司进行测序分析，其测序结果与GenBank中的DRD2基因启动子序列比对后完全一致，证实重组质粒载体构建成功，测序结果(常见多态位点为反向测序，突变位点为正向测序)见图3。

图2 多巴胺D2受体-T和多巴胺D2受体-C重组质粒的双酶切鉴定M.DL15000 DNA Marker;1.pmirGlo-DRD2-T质粒双酶切;2.pmirGlo-DRD2-C质粒双酶切

2.3 荧光素酶报告基因转录活性 转染pmirGlo-DRD2-C质粒的细胞裂解液中荧光素酶活性(0.542±0.004)强于转染pmirGlo-DRD2-T质粒的细胞裂解液(0.474±0.016)，差异有统计学意义(P=0.002)，见图4。

3 讨论

DRD2是最受关注、也是研究最多的多巴胺受体之一。既往研究显示，DRD2是与PTSD关系最为密切的多巴胺受体，因为大多数经典的抗精神病药物的药理学作用中都有拮抗DRD2的作用，且药物效价与拮抗强度有关。动物实验证实边缘系统中杏仁核等区域的多巴胺能神经元对创伤应激高度敏感［6］。在中枢应用DRD2激动剂阿扑吗啡可以降低白鼠实验性创伤应激后的死亡率，而多巴胺受体阻滞剂舒必利则有相反的效果，而PTSD患者的尿中多巴胺及其代谢产物高香草醛酸浓度增高，其水平与症状严重程度相关［7］。PTSD患者中枢神经多巴胺系统可能存在缺陷，而无法适宜地应对创伤应激，导致暂时或持续性的精神异常症状。因此，DRD2基因改变可能是导致各种精神异常行为、精神及神经系统疾病发生的重要原因［8-10］。

自被发现以来，内含子一直是人们争论的焦点。因内含子属于非编码序列，曾一度被认为其存在没有任何意义，是无用基因，因此目前对内含子的功能还知之甚少。然而越来越多的研究发现内含子并不是基因组的“垃圾”，而是在基因表达调控中有重要的生物学功能。另外，在原核生物基因中不存在内含子或含有少量的内含子，而在真核生物基因中内含子的存在是普遍现象，内含子的长度远远大于外显子，甚至在人类基因组中非编码序列占到95% ～97%［11］。由此可见，生物进化程度越高，其内含子所含比例也越高，这也进一步说明内含子是具有重要生物学功能的。对于内含子的功能，目前普遍认为它们与基因的表达调控有关，如内含子含有增强子或其他顺式作用元件，促进转录的起始或延伸，增加了mRNA在核内的稳定性，可充当启动子等。因含有增强启动子的序列，在一些基因中，内含子可增强基因转录的起始反应。内含子由于含有增强子的组分，或由于拼接体及多聚腺昔酸化作用保护mRNA前体，使其免受RNA酶的作用，增强了基因的表达。在另一些基因中，内含子可抑制转录的延长，转录衰减位点可能位于内含子上，从而导致基因的失活［12］。

报告基因是一种编码可供检测的酶或蛋白质的基因，是基因表达调控研究的一个重要工具，通过测定报告基因的表达产物，可以推测出该DNA片段在基因表达调控中的作用［13］。本研究采用高保真PCR法从人全血基因组中扩增出了DRD2基因第3内含子区399 bp的含rs2075652多态位点的序列，并将其分别克隆到pmirGlo-Basic质粒的多克隆位点中，成功构建了人 pmirGlo-DRD2-T和 pmirGlo-DRD2-C荧光素酶报告基因，并证实了rs2075652多态位点由T突变为C后，荧光素酶活性增强，说明DRD2基因第3内含子区55 103位点可能为转录增强位点或具有增强子活性，为研究DRD2基因的转录调控机制提供了基础，但其增强转录活性的具体分子机制还有待于进一步深入研究证实。

图3 重组质粒的pmir Glo-DRD2-T和pmir Glo-DRD2-C的测序结果

图4 重组质粒pmir Glo-DRD2-T和pmir Glo-DRD2-C荧光素酶活性比较结果b P＜0.01

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